大曲是白酒發(fā)酵的核心驅(qū)動力，主要以小麥、大麥或豌豆為原料，在開放環(huán)境下富集微生物自然發(fā)酵而成，其質(zhì)量與白酒的品質(zhì)密切相關(guān)。其中，高溫大曲不僅是醬香型白酒釀造的核心功能菌劑，同時(shí)作為風(fēng)味調(diào)控組分參與多香型白酒的發(fā)酵過程，在大曲中占據(jù)重要地位。

目前研究表明，基于可培養(yǎng)微生物分離技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)分析，可定向選育高產(chǎn)酶或特征風(fēng)味合成的功能菌株，通過內(nèi)源性菌株回添實(shí)現(xiàn)微生態(tài)定向調(diào)控。

貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院的王念、黃永光*，貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院的龔佳欣等以在高溫大曲中普遍存在且具備優(yōu)良釀造性能的內(nèi)源性菌株為基礎(chǔ)，構(gòu)建合成菌群進(jìn)行固態(tài)模擬發(fā)酵，應(yīng)用頂空固相微萃?。℉S-SPME）與氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對不同溫度脅迫下合成菌群揮發(fā)性化合物進(jìn)行表征。采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)揭示溫度脅迫下合成菌群關(guān)鍵基因表達(dá)差異以及風(fēng)味代謝機(jī)制，以期為合成微生物群落構(gòu)建以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。

1 釀造功能菌株發(fā)酵特性分析

為探究

B. licheniformis

S. fibuligera

T. crustaceus

的發(fā)酵特性，采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對產(chǎn)香菌株

B. licheniformis

S. fibuligera

固態(tài)模擬發(fā)酵樣品代謝輪廓進(jìn)行解析，通過酶比活力表征高豐度優(yōu)勢菌株

T. crustaceus

的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如圖1所示。從

B. licheniformis

固態(tài)模擬發(fā)酵樣品中檢出的種類數(shù)量顯著高于之前研究檢出的揮發(fā)性化合物數(shù)量。共檢出63 種主要揮發(fā)性化合物，包括芳香族類11 種、醛酮類11 種、酯類11 種、醇類8 種、酸類7 種、酸類7 種、烷烴類4 種、吡嗪類2 種、酚類1 種和呋喃類1 種。從

S. fibuligera

固態(tài)模擬發(fā)酵樣品中檢出70 種主要揮發(fā)性化合物，包括酯類24 種、醇類16 種、芳香族類8 種、酸類6 種、烷烴類6 種、醛酮類4 種、酚類3 種、醚類2 種和其他類1 種。

T. crustaceus

的纖維素酶、酸性蛋白酶、

-淀粉酶、阿魏酸酯酶比活力分別為3 394.73、47.72、6 438.87、4.79（nmol·g）/min，展現(xiàn)出良好的原料降解能力。模擬發(fā)酵結(jié)果表明

B. licheniformis

S. fibuligera

都具備多途徑代謝活性，能夠合成豐富的揮發(fā)性化合物，但

S. fibuligera

具有更好的環(huán)境適應(yīng)性以及更突出的產(chǎn)酯能力 。

2 不同溫度脅迫誘導(dǎo)合成菌群發(fā)酵關(guān)鍵風(fēng)味代謝物分析

基于偏最小二乘判別分析（PLS-DA）模型對不同溫度條件下合成菌群風(fēng)味譜差異進(jìn)行解析。由圖2a可知，模型參數(shù)

R

2 ＝0.995、

Q

2 ＝0.984，證實(shí)模型具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和預(yù)測效能。3 組樣品呈現(xiàn)明顯的組間分離與組內(nèi)聚集特征，該空間分布特征與揮發(fā)性化合物組成差異顯著相關(guān)，表明不同溫度脅迫對合成菌群的代謝網(wǎng)絡(luò)動態(tài)具有顯著影響。在混菌發(fā)酵體系中，共檢出107 種揮發(fā)性化合物，其中醇類（28 種）、醛酮類（15 種）、芳香族類（11 種）、酸類（5 種）、酯類（29 種）、烷烴類（5 種）、酚類（7 種）、吡嗪類（4 種）、醚類（1 種）及其他類（2 種）。由圖2b可知，T30組揮發(fā)性化合物總質(zhì)量濃度為（16.17±0.99）mg/L，T40組表現(xiàn)出最佳的代謝物積累能力，其揮發(fā)性化合物總質(zhì)量濃度達(dá)到（20.06±0.97）mg/L，而T50組揮發(fā)性化合物總質(zhì)量濃度只有（7.04±0.77）mg/L。發(fā)酵樣品中主要揮發(fā)性化合物總量隨溫度升高呈先升后降趨勢，其中吡嗪類、芳香族類、酚類、酸類及酯類物質(zhì)含量均呈現(xiàn)相似波動規(guī)律，而醇類與醛酮類物質(zhì)含量隨溫度升高持續(xù)降低，醚類及烷烴類僅在T30和T50組被檢出（圖2c）。在物質(zhì)多樣性方面，T30組中檢測到62 種揮發(fā)性化合物，T40組和T50組分別為75 種與58 種（圖2c），進(jìn)一步證實(shí)T40組在揮發(fā)性化合物多樣性方面具有最優(yōu)代謝表現(xiàn)。在組合發(fā)酵中檢測到的吡嗪類物質(zhì)含量顯著高于單菌發(fā)酵，反映出微生物群落的復(fù)雜性及其代謝協(xié)同效應(yīng)有助于吡嗪類物質(zhì)積累，表明發(fā)酵溫度對合成菌群的代謝產(chǎn)物合成能力具有顯著調(diào)控作用 。

以差異倍數(shù)（FC）≥2或FC≤0.5、

P

＜0.05以及變量投影重要性（VIP）＞1為條件篩選差異代謝物（圖3）。與T30組相比，T40組有6 種揮發(fā)性化合物顯著上調(diào)，分別是異丁酸乙酯、3-辛醇、2-十六醇、愈創(chuàng)木酚、3-乙酰氧基丁烷和苯乙醇。說明40 ℃可能激活了苯丙氨酸代謝途徑促進(jìn)苯乙醇的生成，同時(shí)促進(jìn)以愈創(chuàng)木酚為代表的酚類與以2-十六醇為代表的長鏈醇類生成。在T30與T50比較組中，7 種揮發(fā)性化合物下調(diào)（2-甲氧基-4-乙烯苯酚、4-羥基苯乙烯、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、油酸芐酯、異戊醇和2,3-丁二醇）。與T40組相比，高溫對T50組代謝物的生成表現(xiàn)出明顯的抑制作用，包括苯乙醇、異丁酸乙酯、2-甲氧基-四甲基苯酚、2,3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、四甲基吡嗪、甲酸庚酯、異戊醇和2-十六醇在內(nèi)的9 種揮發(fā)性化合物顯著下調(diào)，只有1-甲基丙烯酸十一酯上調(diào)。對這些差異代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共有16 種重點(diǎn)代謝物。T50組代謝物減少，說明50 ℃對風(fēng)味物質(zhì)積累具有顯著負(fù)面影響，這可能與高溫抑制

S. fibuligera

的生長甚至使其失活有關(guān)，在50 ℃時(shí)其無法與其他2 種微生物協(xié)同作用促進(jìn)多種物質(zhì)的生成 。

3 不同溫度脅迫誘導(dǎo)合成菌群代謝通路注釋

在不同溫度微生物模擬發(fā)酵樣品及其平行樣轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究從基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫對各樣品的代謝功能相似性進(jìn)行PCA。如圖4所示，不同溫度下模擬發(fā)酵樣品中合成菌群的代謝表達(dá)存在異同。其中在30 ℃和40 ℃條件下模擬發(fā)酵樣品的距離相對接近，而在50 ℃條件下進(jìn)行模擬發(fā)酵的樣品與其他2 組樣品距離較遠(yuǎn)。這表明合成菌群在30 ℃和40 ℃環(huán)境中的代謝通路較為相似。而在50 ℃環(huán)境中合成菌群的代謝通路產(chǎn)生了明顯的變化。

為進(jìn)一步明確溫度梯度下合成菌群的代謝功能特征，本研究對合成菌群表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫的功能進(jìn)行注釋分析，結(jié)果如圖5a所示。KEGG一級代謝通路表明，合成菌群主要以新陳代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞過程3 類代謝為主，共表達(dá)豐度占90%以上。合成菌群的KEGG二級代謝通路主要包括碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝通路，它們共表達(dá)量可占據(jù)80%以上，這表明合成菌群在初級代謝特別是自身繁殖方面以及大分子物質(zhì)降解方面表達(dá)出強(qiáng)烈的功能特征。如圖5b所示，在50 ℃溫度脅迫發(fā)酵下，合成菌群在氨基酸代謝途徑上顯著上調(diào)1.36～2.33 倍，在環(huán)境適應(yīng)性途徑上顯著上調(diào)2.93～5.14 倍，在細(xì)胞活動途徑上顯著上調(diào)1.35～2.33 倍；相反，此溫度下合成菌群的能量代謝功能表達(dá)下調(diào)57%～74%。氨基酸代謝途徑活躍可能與

Thermoascus

Bacillus

的協(xié)同作用有關(guān)。氨基酸代謝可支持應(yīng)激蛋白合成和滲透調(diào)節(jié)，而脂質(zhì)和能量代謝可以節(jié)省資源并避免代謝負(fù)擔(dān)。結(jié)果說明在溫度脅迫下，合成菌群通過“保核心功能，棄冗余消耗”的策略重新分配代謝資源 。

4 不同溫度脅迫誘導(dǎo)合成菌群基因差異化表達(dá)

圖6展示了不同溫度脅迫發(fā)酵下基于KEGG數(shù)據(jù)庫的合成菌群基因表達(dá)差異。不同溫度對氨基酸代謝、能量代謝的表達(dá)具有影響。在30 ℃條件下，合成菌群主要高表達(dá)基因?yàn)镵00004（

BDH

）、K00655（

PlsC

）、K03621（

plsX

）、K05338（

lrgA

）、K04047（

dps

）等。其中，

BDH

PlsC

是參與代謝的相關(guān)基因，其高表達(dá)通常與能量需求增加或脂質(zhì)合成活躍相關(guān)；

plsX

lrgA

dps

等基因的表達(dá)水平在熱應(yīng)激下上調(diào)，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；K13628（

iscA

）的高表達(dá)在細(xì)胞能量代謝、電子傳遞、底物結(jié)合與激活、鐵/硫存儲、酶促反應(yīng)等諸多過程中具有關(guān)鍵作用。K16509（

spxA

）是

Spx

家族的一個(gè)成員，常見于

Bacillus

Spx

是一種激活因子，能夠激活必要的反應(yīng)以逆轉(zhuǎn)氧化損傷的影響；同時(shí)也是一種負(fù)調(diào)控因子，通過推遲發(fā)育程序和耗能的生長相關(guān)功能協(xié)調(diào)能量分配，以應(yīng)對應(yīng)激。在30 ℃條件下，菌群間協(xié)同效應(yīng)較弱，風(fēng)味代謝活性未顯著激活，整體呈現(xiàn)基礎(chǔ)代謝狀態(tài)。在40 ℃條件下，主要高表達(dá)基因包括K13727（

pdc

）、K01903（

sucC

）、K00260（

gudB

）、K01664（

pabA

）等。

pdc

可催化丙酮酸生成CO 2 和乙醛，乙醛可通過羥醛縮合反應(yīng)生成大分子的醛，隨后經(jīng)還原反應(yīng)生成醇，這也解釋了合成菌群在40 ℃條件下辛醇產(chǎn)量更高的原因（圖3）。

sucC

是檸檬酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將琥珀酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A，對能量代謝和細(xì)胞呼吸至關(guān)重要。

gudB

是芽孢桿菌參與編碼谷氨酸脫氫酶的基因。先前研究表明，大腸桿菌中的

pabA

可調(diào)控氨基苯甲酸，用于合成葉酸（VB 9 ）。在合成菌群中亦檢測到該基因，提示其可能具備相似的調(diào)控功能潛力。在40 ℃發(fā)酵條件下，合成菌群基因組的協(xié)同作用更為顯著，其核心功能基因表達(dá)譜呈現(xiàn)顯著轉(zhuǎn)變，其中調(diào)控風(fēng)味物質(zhì)前體合成的相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)。該現(xiàn)象與T40組中合成菌群風(fēng)味代謝產(chǎn)物多樣性最高的檢測結(jié)果相印證，從而闡明40 ℃條件下合成菌群呈現(xiàn)最豐富風(fēng)味代謝譜的分子機(jī)制。在50 ℃的高溫發(fā)酵條件下，合成菌群的K00927（

dapD

）、K01803（

ilvD

）、K00939（

pgm

）、K02948（

tpiA

）、K02968（

gapA

）、K02950（

eno

）和K01689（

rpe

）等基因呈現(xiàn)爆發(fā)式表達(dá)。

dapD

ilvD

是參與賴氨酸與支鏈氨基酸合成途徑的酶。前人的研究表明，中高溫大曲氨基酸的差異可能與

Thermoascus

Bacillus

等微生物豐度有關(guān)。在本研究中，

dapD

ilvD

基因在高溫組中的高豐度表達(dá)也驗(yàn)證了該結(jié)論。

pgm

tpiA

gapA

eno

rpe

主要參與糖酵解和能量代謝途徑。在高溫脅迫下，合成菌群啟動熱應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制，其代謝活性急劇上調(diào)但發(fā)生功能重定向，此類基因的高表達(dá)主要是通過能量供應(yīng)強(qiáng)化、氧化還原平衡、代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)以適應(yīng)高溫脅迫 。

5 不同溫度脅迫合成菌群中相關(guān)風(fēng)味基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征

以主要差異揮發(fā)性化合物為導(dǎo)向，繪制相關(guān)風(fēng)味基因表達(dá)的代謝通路（圖7）。苯丙氨酸代謝是醬香型白酒風(fēng)味形成的核心生化代謝途徑之一，可產(chǎn)生苯乙醛、苯乙醇等多種芳香族類化合物，該類化合物主要具有玫瑰香氣，對塑造酒體的典型香氣特征具有重要意義。由圖7可知，在苯丙氨酸代謝通路中，T50組的乙醇脫氫酶基因（

ADH5

）相較于T30組和T40組顯著上調(diào)，但由于底物（苯乙醛）匱乏，導(dǎo)致其苯乙醇含量顯著降低。2,3-丁二醇、四甲基吡嗪的含量隨溫度變化顯著波動，但相關(guān)基因的表達(dá)水平未發(fā)生同步響應(yīng)，表明溫度可能通過非轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑（如底物可利用性、輔因子供應(yīng)）驅(qū)動代謝物合成。蘇氨酸代謝途徑是2,3,5-三甲基吡嗪的主要生物合成途徑。蘇氨酸脫氫酶基因（

TDH

）顯著下調(diào)，在該途徑中其他酶作用不明顯的前提下，顯著影響了發(fā)酵后期2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪的積累。此外，多數(shù)下調(diào)的差異代謝物，如異戊醇、異戊酸乙酯等，其生成途徑的調(diào)控基因呈顯著上調(diào)，造成這種不對應(yīng)關(guān)系的原因可能基因表達(dá)調(diào)控是代謝物動態(tài)變化的先導(dǎo)因素。引起揮發(fā)性化合物差異的通路中，與氨基酸代謝關(guān)系最為密切，尤其是支鏈氨基酸與芳香族氨基酸代謝，表明氨基酸代謝對大曲揮發(fā)性化合物的形成有重要影響。在本研究中，氨基酸代謝途徑也是僅次于碳水化合物代謝的最活躍代謝途徑，其通量水平與溫度呈顯著正相關(guān)，可能與熱應(yīng)激下微生物通過氨基酸降解加速能量供給及滲透保護(hù)物質(zhì)合成有關(guān) 。

結(jié) 論

本研究通過固態(tài)模擬發(fā)酵并應(yīng)用HS-SPME-GC-MS技術(shù)解析了溫度脅迫對合成菌群揮發(fā)性化合物代謝的影響，結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了溫度脅迫下合成菌群基因?qū)囟茸兓捻憫?yīng)規(guī)律以及風(fēng)味表達(dá)機(jī)制。揮發(fā)性化合物檢測結(jié)果表明，不同溫度脅迫下，合成菌群的代謝產(chǎn)物和代謝通路表現(xiàn)出顯著差異，在40 ℃條件下，合成菌群的揮發(fā)性化合物種類和含量均達(dá)到最高，最有利于風(fēng)味物質(zhì)的積累。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的合成菌群有助于激發(fā)吡嗪類物質(zhì)的合成與積累。同時(shí)，共篩選出16 種主要差異揮發(fā)性化合物。其中，在T30與T40比較組中，有6 種揮發(fā)性化合物顯著上調(diào)；在T30與T50比較組中，有7 種揮發(fā)性化合物下調(diào)。在T40與T50比較組中，有9 種揮發(fā)性化合物顯著下調(diào)，有1 種揮發(fā)性化合物上調(diào)。宏轉(zhuǎn)錄組分析表明合成菌群在30 ℃和40 ℃環(huán)境中的代謝功能較為相似。而在50 ℃條件下，合成菌群的功能發(fā)生明顯變化。高溫脅迫下，合成菌群通過“保核心功能，棄冗余消耗”的策略重新分配代謝資源以應(yīng)對熱應(yīng)激。在30 ℃條件下，合成菌群主要高表達(dá)基因?yàn)?/p>

BDH

PlsC

plsX

lrgA

dps

等，為維持細(xì)胞生命活動供能。在40 ℃條件下，主要高表達(dá)基因包括

pdc

sucC

gudB

pabA

等，維持微生物正常生理活動的同時(shí)，具有調(diào)控風(fēng)味物質(zhì)前體合成的能力。在50 ℃高溫發(fā)酵條件下，合成菌群主要高表達(dá)基因包括

dapD

ilvD

pgm

tpiA

gapA

eno

rpe

等，主要是通過能量供應(yīng)的強(qiáng)化、氧化還原平衡的維持、代謝網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)以適應(yīng)高溫脅迫，各溫度條件下功能代謝出現(xiàn)明顯差異。同時(shí)，主要差異揮發(fā)性化合物的代謝網(wǎng)絡(luò)也表明氨基酸代謝對大曲揮發(fā)性化合物的形成有重要影響。本研究可為理解溫度脅迫對大曲關(guān)鍵菌群的風(fēng)味代表達(dá)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為優(yōu)化控溫制曲工藝、提升固態(tài)發(fā)酵可控性及人工菌劑開發(fā)提供理論支撐 。

作者簡介

通信作者：

黃永光 教授

貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院 院長

貴州省釀酒工業(yè)協(xié)會秘書長、貴州省白酒產(chǎn)業(yè)促進(jìn)會副秘書長、“黔酒工匠”、中國白酒技術(shù)委員會委員、全國食品工業(yè)科技創(chuàng)新杰出人才、《中國釀造》《釀酒科技》期刊編委等。研究方向包括釀造微生態(tài)結(jié)構(gòu)及其代謝調(diào)控機(jī)理；釀造環(huán)境微生物與釀造微生物互作機(jī)制；酒類風(fēng)味結(jié)構(gòu)特征及其風(fēng)味貢獻(xiàn)機(jī)制；酒類活性功能成分及其健康飲酒；白酒機(jī)械化、智能化釀造關(guān)鍵技術(shù)等。主持國家基金、貴州省重大專項(xiàng)、重大成果轉(zhuǎn)化及產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目30余項(xiàng)，發(fā)表SCI、EI等收錄論文200多篇，主編、參編專著9 部，起草制定發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)16 件，獲國家發(fā)明專利30余件，獲國家級、省部級科學(xué)技術(shù)獎3 項(xiàng)，獲中國食品、酒業(yè)行業(yè)學(xué)會、協(xié)會科學(xué)技術(shù)一等獎等10余項(xiàng) 。

第一作者：

王念碩士研究生

貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院

主要研究方向?yàn)榇笄⑸鷳B(tài)解析與資源挖掘 。

引文格式：

王念, 龔佳欣, 唐杰, 等. 基于發(fā)酵溫度脅迫調(diào)控重組菌群的代謝特征及風(fēng)味表達(dá)機(jī)制[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(22): 227-235. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250515-090.

WANG Nian, GONG Jiaxin, TANG Jie, et al. Regulatory effect of temperature stress on metabolic characteristics and flavor expression mechanism of recombinant microbial communities[J]. Food Science, 2025, 46(22): 227-235. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250515-090.

實(shí)習(xí)編輯：彤禾；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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