現(xiàn)代社會(huì)中, 因經(jīng)濟(jì)、文化、教育等因素的綜合作用, 女性初婚初育年齡顯著推遲, 高齡生育現(xiàn)象日益凸顯. 生育老齡化對(duì)女性的影響遠(yuǎn)高于男性, 這是因?yàn)槟行陨诚抵谐掷m(xù)存在具增殖能力的干細(xì)胞群, 長(zhǎng)期維持產(chǎn)生精子的能力; 而女性的卵巢儲(chǔ)備在胚胎發(fā)育階段就已建立完成, 在其生育周期中幾乎不再增加. 尤為關(guān)鍵的是, 卵母細(xì)胞發(fā)育成熟后進(jìn)入生發(fā)泡期(germinal vesicle, GV), 其減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)可持續(xù)數(shù)十年. 這種長(zhǎng)期阻滯導(dǎo)致GV期卵母細(xì)胞持續(xù)累積損傷, 是其衰老的直接誘因. 女性35歲后卵巢儲(chǔ)備顯著降低, 直接表現(xiàn)為卵母細(xì)胞數(shù)量與質(zhì)量的下降 [1] , 其核心機(jī)制與基因組不穩(wěn)定性(特別是染色體異常)的急劇升高密切相關(guān) [2] .

端粒是位于真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu), 由串聯(lián)重復(fù)序列及Shelterin蛋白復(fù)合體組成. 端粒通過(guò)T-loop防止染色體末端被識(shí)別為DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSBs), 從而維持基因組穩(wěn)定性 [3] . 在具有增殖能力的真核細(xì)胞中, 端粒隨DNA復(fù)制而不斷縮短. 當(dāng)其縮短到一定閾值后, 端粒對(duì)DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response, DDR)的抑制效應(yīng)減弱, 將誘發(fā)染色體融合等基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象, 導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯甚至凋亡 [4] . 然而, 對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等非分裂細(xì)胞以及GV期阻滯的卵母細(xì)胞, 由于缺乏復(fù)制性來(lái)源的端?？s短, 其端粒功能障礙應(yīng)主要來(lái)源于累積性的DNA損傷 [5] . 目前卵母細(xì)胞端粒研究多沿襲體細(xì)胞范式, 聚焦端粒酶活性、端粒長(zhǎng)度及其對(duì)受精和胚胎發(fā)育的影響. 然而, 卵母細(xì)胞在細(xì)胞周期、胞質(zhì)體積、細(xì)胞數(shù)量等方面與體細(xì)胞存在顯著差異, 目前仍缺乏特異性研究卵母細(xì)胞中端粒DNA損傷的技術(shù)手段. 因此, 端粒DNA損傷如何影響卵母細(xì)胞發(fā)育, 以及卵母細(xì)胞如何響應(yīng)端粒DNA損傷也仍然未知.

近日, 中山大學(xué)黃軍就課題組 [6] 通過(guò)分析臨床捐獻(xiàn)的人卵母細(xì)胞樣本發(fā)現(xiàn), GV期卵母細(xì)胞中近一半的自發(fā)DNA損傷定位于端粒區(qū)域, 為解析卵母細(xì)胞對(duì)端粒DNA損傷的應(yīng)答機(jī)制, 我們整合CRISPR/Cas9與中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所劉光慧研究員團(tuán)隊(duì)開發(fā)的TTALE(thioredoxin-fused transcription activator-like effector)三維基因組成像系統(tǒng) [7] , 首次在小鼠卵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了端粒DNA的特異性損傷誘導(dǎo)與實(shí)時(shí)示蹤( 圖1 ). 基于該模型, 我們發(fā)現(xiàn)端粒受損的卵母細(xì)胞染色體不穩(wěn)定, 體外成熟率下降且染色體排列異常, 這說(shuō)明端粒DNA損傷直接影響卵母細(xì)胞的發(fā)育質(zhì)量.

圖 1 生殖衰老過(guò)程中端粒DDR不充分導(dǎo)致卵母細(xì)胞染色體不穩(wěn)定的機(jī)制. (a) 哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的端粒DNA損傷應(yīng)答機(jī)制(DDR); (b) 生殖衰老中不充分的BITS導(dǎo)致卵母細(xì)胞染色體不穩(wěn)定

利用四維活細(xì)胞共聚焦成像技術(shù), 我們發(fā)現(xiàn)端粒受損的GV期卵母細(xì)胞中端粒運(yùn)動(dòng)速度顯著加快. 已知體細(xì)胞中此類加速現(xiàn)象與RAD51重組酶介導(dǎo)的同源重組修復(fù)(homologous recombination, HR) [8] , 或53BP1(p53-binding protein 1)驅(qū)動(dòng)的非同源末端連接(non-homologous end-joining, NHEJ)相關(guān) [9] . 為闡明相關(guān)機(jī)制, 我們利用三維免疫熒光技術(shù)解析受損端粒的DDR因子募集特征. 意外的是, NHEJ通路關(guān)鍵因子RNF8(E3 ubiquitin-protein ligase)在受損端粒的招募水平較低, 可能導(dǎo)致其下游53BP1的募集減少. 并且, Cas9產(chǎn)生的端粒DNA損傷也沒(méi)有在卵母細(xì)胞中引發(fā)端粒融合, 表明NHEJ相關(guān)通路未參與卵母細(xì)胞的DDR過(guò)程. 相反, HR通路關(guān)鍵因子RPA32(replication protein A 32 kD subunit)、RAD51在GV卵母細(xì)胞中被高效招募到受損端粒上, 與ATR(serine/threonine-protein kinase ATR)和PARP1(poly (ADP–ribose) polymerase 1)共同促進(jìn)斷裂誘導(dǎo)的端粒合成(break-induced telomere synthesis, BITS). 上述證據(jù)揭示, 卵母細(xì)胞主要依賴HR相關(guān)機(jī)制響應(yīng)端粒DNA損傷, 而這種偏好性可能有助于更好地維持遺傳信息的保真性, 并提升卵母細(xì)胞的利用效率.

更重要的是, 我們?cè)谂R床GV期卵母細(xì)胞樣本中也檢測(cè)到了BITS. 基于小鼠卵母細(xì)胞模型的深入研究發(fā)現(xiàn), 老齡卵母細(xì)胞中RAD51蛋白表達(dá)量未顯著改變, 且仍能響應(yīng)DNA損傷信號(hào). 然而, 由于端粒上的DDR效率通常低于非端粒區(qū) [10] , 在老年卵母細(xì)胞整體DNA損傷水平累積的前提下, RAD51介導(dǎo)的相關(guān)DDR活動(dòng)更集中在非端粒區(qū), 導(dǎo)致了BITS的不足. 這一機(jī)制加劇了基因組不穩(wěn)定性, 顯著提升了老齡卵母細(xì)胞在遭受端粒DNA損傷時(shí)產(chǎn)生染色體非整倍性變異的頻率.

綜上所述, 本研究系統(tǒng)闡明卵母細(xì)胞端粒DDR的核心機(jī)制, 為端粒DNA損傷降低卵子質(zhì)量提供了直接證據(jù), 并證實(shí)端粒DDR缺陷是老齡卵母細(xì)胞基因組不穩(wěn)定的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素. 雖然針對(duì)已衰老卵母細(xì)胞的單一DDR因子干預(yù)可能難以顯著逆轉(zhuǎn)卵子質(zhì)量, 但未來(lái)研究或許可以嘗試從年輕階段開始干預(yù), 減少衰老過(guò)程中卵母細(xì)胞端粒DNA損傷的累積, 從而延緩卵母細(xì)胞質(zhì)量與數(shù)量的衰退進(jìn)程. 這一發(fā)現(xiàn)將有助于人們更好地解析端粒功能障礙在女性生殖衰老中的生理意義, 并為延長(zhǎng)女性生育年齡的臨床策略提供關(guān)鍵理論支撐.

參考文獻(xiàn)

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