現代社會中, 因經濟、文化、教育等因素的綜合作用, 女性初婚初育年齡顯著推遲, 高齡生育現象日益凸顯. 生育老齡化對女性的影響遠高于男性, 這是因為男性生殖系中持續(xù)存在具增殖能力的干細胞群, 長期維持產生精子的能力; 而女性的卵巢儲備在胚胎發(fā)育階段就已建立完成, 在其生育周期中幾乎不再增加. 尤為關鍵的是, 卵母細胞發(fā)育成熟后進入生發(fā)泡期(germinal vesicle, GV), 其減數分裂阻滯狀態(tài)可持續(xù)數十年. 這種長期阻滯導致GV期卵母細胞持續(xù)累積損傷, 是其衰老的直接誘因. 女性35歲后卵巢儲備顯著降低, 直接表現為卵母細胞數量與質量的下降 [1] , 其核心機制與基因組不穩(wěn)定性(特別是染色體異常)的急劇升高密切相關 [2] .

端粒是位于真核生物染色體末端的特殊結構, 由串聯重復序列及Shelterin蛋白復合體組成. 端粒通過T-loop防止染色體末端被識別為DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSBs), 從而維持基因組穩(wěn)定性 [3] . 在具有增殖能力的真核細胞中, 端粒隨DNA復制而不斷縮短. 當其縮短到一定閾值后, 端粒對DNA損傷應答(DNA damage response, DDR)的抑制效應減弱, 將誘發(fā)染色體融合等基因組不穩(wěn)定現象, 導致細胞周期阻滯甚至凋亡 [4] . 然而, 對于神經細胞、心肌細胞等非分裂細胞以及GV期阻滯的卵母細胞, 由于缺乏復制性來源的端粒縮短, 其端粒功能障礙應主要來源于累積性的DNA損傷 [5] . 目前卵母細胞端粒研究多沿襲體細胞范式, 聚焦端粒酶活性、端粒長度及其對受精和胚胎發(fā)育的影響. 然而, 卵母細胞在細胞周期、胞質體積、細胞數量等方面與體細胞存在顯著差異, 目前仍缺乏特異性研究卵母細胞中端粒DNA損傷的技術手段. 因此, 端粒DNA損傷如何影響卵母細胞發(fā)育, 以及卵母細胞如何響應端粒DNA損傷也仍然未知.

近日, 中山大學黃軍就課題組 [6] 通過分析臨床捐獻的人卵母細胞樣本發(fā)現, GV期卵母細胞中近一半的自發(fā)DNA損傷定位于端粒區(qū)域, 為解析卵母細胞對端粒DNA損傷的應答機制, 我們整合CRISPR/Cas9與中國科學院動物研究所劉光慧研究員團隊開發(fā)的TTALE(thioredoxin-fused transcription activator-like effector)三維基因組成像系統(tǒng) [7] , 首次在小鼠卵母細胞中實現了端粒DNA的特異性損傷誘導與實時示蹤( 圖1 ). 基于該模型, 我們發(fā)現端粒受損的卵母細胞染色體不穩(wěn)定, 體外成熟率下降且染色體排列異常, 這說明端粒DNA損傷直接影響卵母細胞的發(fā)育質量.

圖 1 生殖衰老過程中端粒DDR不充分導致卵母細胞染色體不穩(wěn)定的機制. (a) 哺乳動物卵母細胞的端粒DNA損傷應答機制(DDR); (b) 生殖衰老中不充分的BITS導致卵母細胞染色體不穩(wěn)定

利用四維活細胞共聚焦成像技術, 我們發(fā)現端粒受損的GV期卵母細胞中端粒運動速度顯著加快. 已知體細胞中此類加速現象與RAD51重組酶介導的同源重組修復(homologous recombination, HR) [8] , 或53BP1(p53-binding protein 1)驅動的非同源末端連接(non-homologous end-joining, NHEJ)相關 [9] . 為闡明相關機制, 我們利用三維免疫熒光技術解析受損端粒的DDR因子募集特征. 意外的是, NHEJ通路關鍵因子RNF8(E3 ubiquitin-protein ligase)在受損端粒的招募水平較低, 可能導致其下游53BP1的募集減少. 并且, Cas9產生的端粒DNA損傷也沒有在卵母細胞中引發(fā)端粒融合, 表明NHEJ相關通路未參與卵母細胞的DDR過程. 相反, HR通路關鍵因子RPA32(replication protein A 32 kD subunit)、RAD51在GV卵母細胞中被高效招募到受損端粒上, 與ATR(serine/threonine-protein kinase ATR)和PARP1(poly (ADP–ribose) polymerase 1)共同促進斷裂誘導的端粒合成(break-induced telomere synthesis, BITS). 上述證據揭示, 卵母細胞主要依賴HR相關機制響應端粒DNA損傷, 而這種偏好性可能有助于更好地維持遺傳信息的保真性, 并提升卵母細胞的利用效率.

更重要的是, 我們在臨床GV期卵母細胞樣本中也檢測到了BITS. 基于小鼠卵母細胞模型的深入研究發(fā)現, 老齡卵母細胞中RAD51蛋白表達量未顯著改變, 且仍能響應DNA損傷信號. 然而, 由于端粒上的DDR效率通常低于非端粒區(qū) [10] , 在老年卵母細胞整體DNA損傷水平累積的前提下, RAD51介導的相關DDR活動更集中在非端粒區(qū), 導致了BITS的不足. 這一機制加劇了基因組不穩(wěn)定性, 顯著提升了老齡卵母細胞在遭受端粒DNA損傷時產生染色體非整倍性變異的頻率.

綜上所述, 本研究系統(tǒng)闡明卵母細胞端粒DDR的核心機制, 為端粒DNA損傷降低卵子質量提供了直接證據, 并證實端粒DDR缺陷是老齡卵母細胞基因組不穩(wěn)定的關鍵驅動因素. 雖然針對已衰老卵母細胞的單一DDR因子干預可能難以顯著逆轉卵子質量, 但未來研究或許可以嘗試從年輕階段開始干預, 減少衰老過程中卵母細胞端粒DNA損傷的累積, 從而延緩卵母細胞質量與數量的衰退進程. 這一發(fā)現將有助于人們更好地解析端粒功能障礙在女性生殖衰老中的生理意義, 并為延長女性生育年齡的臨床策略提供關鍵理論支撐.

參考文獻

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[2] Gruhn J R, Zielinska A P, Shukla V, et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span . Science , 2019 , 365: 1466 -1469

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[10] Fumagalli M, Rossiello F, Clerici M, et al. Telomeric DNA damage is irreparable and causes persistent DNA-damage-response activation . Nat Cell Biol , 2012 , 14: 355 -365

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