編輯丨王多魚

排版丨水成文

CRISPR/Cas9 基因編輯技術已成為 21 世紀生物醫(yī)學領域最具突破性的基因編輯工具，在基礎研究和轉化醫(yī)學方面展現(xiàn)巨大潛力。然而，CRISPR/Cas9 技術仍面臨許多亟須解決的技術挑戰(zhàn)。其一，精準且安全編輯挑戰(zhàn)。CRISPR/Cas9 技術依賴基因組 DNA 雙鏈斷裂（DSB）或單鏈斷裂（SSB）來介導基因編輯事件發(fā)生。斷裂的 DNA 極易誘發(fā)非同源末端連接（NHEJ）修復通路，進一步引發(fā)潛在的基因組不穩(wěn)定性和細胞毒性效應。其二，長片段高效插入挑戰(zhàn)�，F(xiàn)有基因編輯工具大多用于短序列 DNA 片段的插入或編輯，同源定向修復（HDR）作為介導精準大片段基因敲入的關鍵修復機制，受限于特定的細胞周期。因此，其固有效率難以在哺乳動物細胞中實現(xiàn)長片段 DNA（千堿基級）的精準插入。

2026 年 1 月 22 日，南京醫(yī)科大學王成坤教授、韓峰教授及中國科學技術大學鮑堅強研究員團隊合作（羅怡寧、蔣琴、屈元昊和李文卿為論文共同第一作者），在Nucleic Acids Research期刊發(fā)表了題為：Compact bacterial recombination complexes drive efficient kilobase-scale knock-in in mammalian cells的研究論文。

該研究通過系統(tǒng)性功能篩選，開發(fā)了一種基于微生物來源EcRecE核酸外切酶的精準基因編輯工具——Cas9-EcRecE，該編輯系統(tǒng)在哺乳動物細胞中顯著提高長片段DNA（千堿基級）的精準插入效率。同時，基于dCas9，該研究進一步構建了無需依賴 DNA雙鏈斷裂（DSB）的安全基因組編輯工具——dCas9-EcRecTE，為實現(xiàn)安全高效的基因編輯提供新的技術支持。

為實現(xiàn)高效且精準的 HDR 修復，王成坤研究團隊的前期工作已闡明噬菌體來源的 SSAP-RecT 可顯著增強哺乳動物細胞中千堿基級 DNA 片段的精準插入效率，并基于此開發(fā)了REDIT（RecE/T-mediated DNA Integration Technology）大片段敲入技術（Wang et al., 2021, Nucleic Acids Research）及dCas9-SSAP（Wang et al., 2022, Nature Cell Biology），但這兩項技術的編輯效率仍有提升空間。

RecE 核酸外切酶是源自 Rac 原噬菌體的另一關鍵同源重組蛋白，常與 RecT 單鏈退火蛋白（SSAP）協(xié)同發(fā)揮作用。在微生物同源重組過程中，RecE 核酸外切酶沿 5'-3' 方向切割斷裂DNA末端形成 3' 單鏈懸垂，而 RecT 單鏈退火蛋白則通過鏈退火或鏈交換促進重組過程的完成。

基于 SAM 招募（MS2-MCP系統(tǒng)）策略，研究團隊評估了 3 種微生物核來源酸外切酶，并成功挖掘大腸桿菌來源的EcRecE能顯著增強 HDR 活性（圖1），在多類型細胞和多個基因位點展現(xiàn)出強大的編輯普適性。此外，EcRecE 的應用不會顯著增加 Cas9 的脫靶風險，是一種安全且精準的新型基因編輯工具。

圖1

進一步，研究團隊通過優(yōu)化同源修復模板、蛋白核定位信號和發(fā)開迷你型 EcRecE等手段開發(fā)了基于miniRecE、miniRecTE和saCas9的雙 AAV 遞送策略，在 HEK293T 細胞中實現(xiàn)了 ~20% 的 HDR 效率，為體內(nèi)基因編輯提供了可行方案（圖2）。

圖2

值得注意的是，研究團隊同樣利用 EcRecE 開發(fā)了不依賴 DNA 雙鏈斷裂的dCas9-EcRecTE基因編輯工具，并在 HEK293T 細胞以及原代小鼠神經(jīng)元中實現(xiàn)高效的長片段DNA（千堿基級）的精準插入（圖3）。

圖3

總的來說，該研究通過系統(tǒng)性挖掘微生物來源同源重組關鍵蛋白，首次開發(fā)基于 EcRecE 核酸外切酶及其迷你型變體的高效基因編輯工具。這一新型基因組編輯工具不僅突破了哺乳動物細胞中千堿基級外源 DNA 片段難以實現(xiàn)高效插入的技術瓶頸，更創(chuàng)新性地實現(xiàn)了無基因組損傷的高效dCas9-EcRecTE 基因編輯工具，為基因治療及相關臨床轉化應用奠定了堅實的技術基礎。

2025 年 12 月 10 日，中國科學技術大學鮑堅強/程臨釗團隊聯(lián)合南京醫(yī)科大學王成坤團隊及山東大學劉洪彬/張友明團隊（李文卿、劉森泉、方曉雨和鄒佳琦為論文共同第一作者），在Nature Communications期刊發(fā)表了題為：Efficient high-precision transgene knock-in by Recombinases (Redα/β)-enhanced DNA integration-CRISPR-Cas9 (RED-CRISPR) 的研究論文。

該研究報道了基于λ 噬菌體的同源重組系統(tǒng)（Redα/Redβ）增強 CRISPR/Cas9 介導大片段 DNA（千堿基級）精準編輯技術——RED-CRISPR系統(tǒng)。

Redα/Redβ 系統(tǒng)是源自 λ 噬菌體的另一高效同源重組 系統(tǒng)。其中，Redα 為 5'→3' 核酸外切酶，Redβ 是單鏈 DNA 退火蛋白。Redα/β 系統(tǒng)與 RecE/T 系統(tǒng)具有相似的同源重組機制，有望在哺乳動物細胞中介導介導大片段 DNA （千堿基級）精準、高效的插入。

在這一新研究中，研究團隊通過優(yōu)化招募方式、蛋白間 linker 和核定位信號（NLS）等方法，最終驗證了Cas9-Redα-Redβ 融合蛋白這一組合能顯著提高哺乳動物細胞中 HDR 的活性（在 HEK293T細胞系中實現(xiàn)了 ~20% 的 IRES-mCherry敲入效率），優(yōu)于其他組合。因此，研究團隊將 Cas9-Redα-Redβ 命名為RED-CRISPR系統(tǒng)。

進一步，通過聯(lián)用 RED-CRISPR、小分子 HDR 增強劑、CTS 同源修復模板，最終可在細胞系中實現(xiàn) ＞40% 的千堿基級 DNA敲入效率。值得注意的是，GUIDE-seq 和 PEM-seq 分析揭示RED-CRISPR系統(tǒng)編輯時脫靶編輯事件和染色質(zhì)易位事件顯著降低，且不會表明未造成額外的細胞毒性。因此，RED-CRISPR具有更高的安全性，有潛在的臨床應用價值。

最后，研究團隊利用 RED-CRISPR 系統(tǒng)開展了許多疾病應用探索。RED-CRISPR 系統(tǒng)能在人類原代 T 細胞及iPSC中的實現(xiàn)了有效 mKate 熒光蛋白的敲入，且未顯著影響細胞正常的生理功能。同時，研究團隊也在鐮狀細胞病（SCD）相關的 iPSC 細胞系（TNC1），實現(xiàn)了HBB cDNA 精準的插入。進一步，研究團隊探索了 RED-CRISPR 系統(tǒng)介導大片段基因敲入小鼠模型構建及CAR-T細胞制備的能力。

研究結果顯示，利用 RED-CRISPR 可有效介導 T 細胞在 TRAC 位點精準敲入約 2 kb 的 2A-CAR-pA 表達盒，編輯效率相較 Cas9 提升至44.3%，并檢測到較低的脫靶事件及染色質(zhì)易位事件的發(fā)生效率；而 RED-CRISPR 系統(tǒng)也可有效進行大片段基因敲入以制備大片段基因敲入小鼠模型，效率相較 Cas9 組效率提升了17 倍。

總的來說，該研究證實，RED-CRISPR 系統(tǒng)作為一種高效精準的千堿基級外源 DNA 整合技術，在多個生物醫(yī)學領域展現(xiàn)出廣闊的應用前景，包括：大片段轉基因動物模型的高效構建、CAR-T細胞制備等免疫治療基因工程改造，以及致病性基因突變位點的精準校正等臨床轉化應用場景。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkag020

https://doi.org/10.1038/s41467-025-67239-w