由蘭州大學(xué) / 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所鄭海學(xué)研究員、楊帆研究員和朱紫祥研究員為通訊作者2025 年 12 月在 Autophagy 上發(fā)表了題為 “Picornavirus VP2 protein suppresses innate immunity through selective autophagic degradation of IKBKE/IKKε” 的研究論文。本研究揭示了小核糖核酸病毒結(jié)構(gòu)蛋白 VP2 抑制宿主先天免疫的新型分子機制，闡明了其通過招募 E3 泛素連接酶 RNF114 促進(jìn) IKBKE 的 K33 連接泛素化，進(jìn)而經(jīng) CALCOCO2 介導(dǎo)的選擇性自噬降解 IKBKE 的核心功能，且該機制在小核糖核酸病毒中具有保守性。

先天免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防線，IKBKE 作為先天免疫通路的關(guān)鍵激酶，可磷酸化 IRF3/7 啟動 I 型干擾素產(chǎn)生，而小核糖核酸病毒已進(jìn)化出多種策略逃避免疫監(jiān)視。選擇性自噬是病毒操縱宿主免疫的重要途徑，已有研究表明小核糖核酸病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白可通過自噬降解免疫分子，但結(jié)構(gòu)蛋白 VP2 在先天免疫調(diào)控中的作用尚未明確。

已知小核糖核酸病毒 VP2 參與病毒顆粒組裝和入侵，但能否及如何調(diào)控自噬與先天免疫的交叉通路仍屬未知；IKBKE 常成為病毒靶向的關(guān)鍵分子，但小核糖核酸病毒是否通過自噬降解 IKBKE、其具體調(diào)控的泛素化類型及自噬受體尚未闡明。此外，不同小核糖核酸病毒 VP2 的功能是否保守，也缺乏系統(tǒng)研究。本研究聚焦小核糖核酸病毒 VP2 與選擇性自噬、先天免疫的互作機制，解析其降解 IKBKE 的分子路徑及保守性，為理解病毒免疫逃逸策略提供理論基礎(chǔ)。

1. SVA VP2 抑制 I 型 IFN 產(chǎn)生和 ISGs 表達(dá)

為探究 SVA 結(jié)構(gòu)蛋白對先天免疫的調(diào)控作用，將 SVA VP2 等結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)染 HEK-293T 和 PK-15 細(xì)胞，用 SeV 或 poly (I:C) 激活 I 型 IFN 通路。結(jié)果顯示，VP2 顯著抑制 IFNB 和 ISRE 啟動子活性（圖 1A-B），且呈劑量依賴性阻斷 SeV/poly (I:C) 誘導(dǎo)的 IFNB 啟動子激活（圖 1C-D）；qPCR 檢測發(fā)現(xiàn) VP2 顯著降低 IFNB 及 IFIT2、OAS1 等 ISGs 的 mRNA 水平（圖 1E-F）。敲低 VP2 后，SVA 對 poly (I:C) 誘導(dǎo)的 ISGs 表達(dá)抑制作用減弱（圖 1G）。這些表明，SVA VP2 可有效阻斷 I 型 IFN 信號通路，抑制宿主抗病毒先天免疫應(yīng)答。

2. SVA VP2 特異性靶向降解 IKBKE

為明確 VP2 調(diào)控 IFN 通路的分子靶點，檢測 RLR 通路核心分子表達(dá)。WB 結(jié)果顯示，VP2 僅顯著下調(diào) IKBKE 蛋白水平，對 MDA5、RIGI 等其他分子無影響（圖 2A）；轉(zhuǎn)染 VP2 可劑量依賴性降解 HA 標(biāo)簽及內(nèi)源性 IKBKE，不影響 HA-RIGI、HA-IRF3（圖 2B-D、S2A-C）。qPCR 證實 VP2 不影響 IKBKE mRNA 表達(dá)（圖 2E、S2F）；SVA 感染后，IKBKE 蛋白隨感染時間逐漸減少，mRNA 無變化（圖 2F-G、S2G-H）。這些表明，SVA VP2 在蛋白水平特異性靶向降解 IKBKE，且該效應(yīng)在人源和豬源細(xì)胞中均存在。

3. SVA VP2 與 IKBKE 和 RIGI 相互作用

為驗證 VP2 與免疫分子的相互作用，通過 co-IP 實驗發(fā)現(xiàn)，VP2 可特異性結(jié)合 IKBKE 和 RIGI，不與 MDA5、MAVS 等其他分子相互作用（圖 2H-I、S2I-K）；SVA 感染時，VP2 與 IKBKE 在細(xì)胞質(zhì)中共定位（圖 2K、S2L），且與 RIGI 也存在胞質(zhì)共定位（圖 S2M）。進(jìn)一步檢測顯示，VP2 可抑制 TBK1 與 IKBKE、IKBKE 與 IRF3 的相互作用（圖 2L-M），但不影響 RIGI 與 MAVS 的結(jié)合（圖 S2N）。這些表明，VP2 通過與 IKBKE、RIGI 直接相互作用，干擾 I 型 IFN 信號復(fù)合物的形成，阻礙信號傳導(dǎo)。

4. SVA VP2 通過 CALCOCO2 介導(dǎo)的選擇性自噬降解 IKBKE

為闡明 IKBKE 的降解途徑，用蛋白酶體抑制劑 MG132、溶酶體抑制劑 CQ/3-MA 處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，CQ 和 3-MA 可逆轉(zhuǎn) VP2 誘導(dǎo)的 IKBKE 降解，MG132 無作用（圖 3A）；VP2 可促進(jìn) LC3-I 向 LC3-II 轉(zhuǎn)化，增加 LC3 自噬體 形成（圖 3B-C、S3A-B）。篩選自噬受體發(fā)現(xiàn)，僅 CALCOCO2 可增強 VP2 對 IKBKE 的降解，且 VP2 與 CALCOCO2 在感染時相互作用并共定位（圖 3D-F）。CALCOCO2 敲除細(xì)胞中，VP2 無法降解 IKBKE，SVA 復(fù)制及對 ISGs 的抑制作用均減弱（圖 3G-K）。這些表明，VP2 通過 CALCOCO2 介導(dǎo)的選擇性自噬降解 IKBKE，促進(jìn)病毒復(fù)制。

5. SVA VP2 增強 IKBKE 的 K33 連接泛素化（K490 位點）

為探究自噬降解的分子標(biāo)記，檢測 IKBKE 的泛素化修飾。結(jié)果顯示，VP2 可劑量依賴性增強 IKBKE 的總泛素化，且特異性促進(jìn) K33 連接泛素化（圖 4A-B、S4A），不影響 K63 連接泛素化（圖 S4B）。通過賴氨酸突變篩選發(fā)現(xiàn)，僅 IKBKE K490R 突變可顯著阻斷 VP2 誘導(dǎo)的泛素化及降解，其他位點突變無影響（圖 4C-D）。這些表明，VP2 通過促進(jìn) IKBKE K490 位點的 K33 連接泛素化，為 CALCOCO2 識別提供分子信號，進(jìn)而介導(dǎo)其自噬降解。

6. RNF114 是介導(dǎo) IKBKE 泛素化的 E3 連接酶

為篩選介導(dǎo) IKBKE 泛素化的 E3 連接酶，通過質(zhì)譜鑒定并驗證發(fā)現(xiàn)，VP2 可與 RNF114 等互作，且 IKBKE 特異性結(jié)合 RNF114（圖 5A-B、S5A-B）。RNF114 可降解 IKBKE 并增強 VP2 的降解效應(yīng)，敲低 RNF114 后，IKBKE 降解受阻（圖 5C-D）；RNF114 可促進(jìn) IKBKE 的 K33 連接泛素化（圖 S5C），VP2 可劑量依賴性增強 IKBKE 與 RNF114 的相互作用（圖 5F）。敲低 RNF114 后，SVA 復(fù)制及對 ISGs 的抑制作用減弱（圖 5G-J）。這些表明，RNF114 是 VP2 介導(dǎo) IKBKE K33 泛素化的關(guān)鍵 E3 連接酶。

7. VP2 的特定區(qū)域和關(guān)鍵殘基介導(dǎo)與 IKBKE 的相互作用

為明確 VP2 與 IKBKE 相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，構(gòu)建 VP2 缺失突變體發(fā)現(xiàn)，aa1-80 和 aa201-284 區(qū)域是降解 IKBKE 及抑制 IFN 通路的關(guān)鍵（圖 6A-E）；IKBKE 的 ΔPK 和 ΔDDX3X 突變體仍可被 VP2 降解并結(jié)合（圖 6F-H）。點突變驗證顯示，IKBKE 的 E148 殘基及 VP2 的 C34、D39、T41、R210 殘基是相互作用的核心，突變后結(jié)合及降解均受阻（圖 7A-E）。這些表明，VP2 通過特定功能區(qū)域和關(guān)鍵氨基酸殘基與 IKBKE 相互作用，介導(dǎo)其降解。

8. 小核糖核酸病毒 VP2 蛋白功能保守

為驗證 VP2 功能的保守性，轉(zhuǎn)染 FMDV、EV71 的 VP2。結(jié)果顯示，三者均能抑制 IFNB 和 ISRE 啟動子活性（圖 8A）；SVA-VP2、EV71-VP2 在 HEK-293T 中，F(xiàn)MDV-VP2 在 PK-15 中均可降解 IKBKE，且依賴 ATG7/ATG5 及 CALCOCO2（圖 8B-I）。序列比對顯示，VP2 的關(guān)鍵殘基 R210 在三者中高度保守（圖 S6）。這些表明，小核糖核酸病毒的 VP2 蛋白共享 “泛素化 - 選擇性自噬” 降解 IKBKE 的保守機制，抑制先天免疫。

9. 自噬對小核糖核酸病毒復(fù)制至關(guān)重要

為探究自噬在病毒復(fù)制中的作用，使用 ATG7、ATG5、CALCOCO2 敲除細(xì)胞系感染 SVA、EV71、FMDV。結(jié)果顯示，敲除后 IKBKE 降解受阻，病毒 3D 蛋白表達(dá)、mRNA 轉(zhuǎn)錄及病毒滴度均顯著降低（圖 9A-L、S7A-F）；過表達(dá) VP2 可促進(jìn) SVA、FMDV、EV71 的復(fù)制（圖 S7G-L）。這些表明，小核糖核酸病毒依賴自噬途徑降解 IKBKE，解除宿主先天免疫抑制，進(jìn)而促進(jìn)自身復(fù)制，自噬是其復(fù)制的關(guān)鍵支撐。

本研究揭示了小核糖核酸病毒 VP2 蛋白通過選擇性自噬降解 IKBKE 以抑制先天免疫的保守機制：VP2 招募 E3 泛素連接酶 RNF114，促進(jìn) IKBKE 在 K490 位點發(fā)生 K33 連接泛素化修飾，隨后被選擇性自噬受體 CALCOCO2 識別并轉(zhuǎn)運至自噬體降解，進(jìn)而阻斷 I 型干擾素通路，促進(jìn)病毒復(fù)制；且 SVA、FMDV、EV71 等小核糖核酸病毒的 VP2 蛋白均具備該功能，證實其保守性。

本研究為開發(fā)靶向 VP2-RNF114-CALCOCO2-IKBKE 通路的抗病毒藥物提供了新思路，也為優(yōu)化小核糖核酸病毒溶瘤療法提供了理論依據(jù)，有望為相關(guān)疾病治療開辟新方向。

來源：ZhaoSunLab

編輯：吃一口小貓