聽力損失已成為日益普遍的全球性健康問題，其背后的風險因素復雜多樣，包括感染、缺氧、噪音暴露以及耳毒性藥物的使用。其中，化療藥物順鉑引發(fā)的耳毒性尤為突出，它通過誘導耳蝸毛細胞凋亡，導致不可逆的聽覺細胞損失，最終造成永久性的感音神經(jīng)性聽力損傷。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局僅批準硫代硫酸鈉用于預防兒童患者順鉑治療后的聽力障礙，凸顯了開發(fā)新型聽力保護策略的迫切性。然而，傳統(tǒng)的藥物耳毒性評估方法，如使用永生化細胞系，無法完全分化為功能性毛細胞，也缺乏內(nèi)耳復雜的三維結構，難以準確模擬體內(nèi)病理過程。盡管耳蝸基底膜模型和動物模型為研究聽覺恢復的分子機制提供了寶貴信息，但其在可擴展性上的局限限制了其在藥物篩選中的廣泛應用。因此，構建更具生理相關性、能精準模擬內(nèi)耳損傷與保護機制的新模型，并探索新的治療干預手段，成為領域內(nèi)的迫切需求。

針對這一挑戰(zhàn)，東南大學研究人員開發(fā)了一種超聲激活的壓電水凝膠，用于促進內(nèi)耳類器官的成熟，為評估中藥成分（如白藜蘆醇）的耳保護功效提供了更準確、有效的模型。該研究利用嵌入鈦酸鋇納米顆粒的明膠甲基丙烯酰水凝膠，在超聲刺激下產(chǎn)生三維電信號，從而加速內(nèi)耳類器官中聽覺神經(jīng)元的分化與成熟，并成功構建了包含功能性毛細胞和感覺神經(jīng)元的復雜結構。利用這一增強型平臺，研究證實了白藜蘆醇能通過減輕線粒體功能障礙、減少活性氧積累及抑制鐵死亡，有效緩解順鉑誘導的毛細胞和神經(jīng)元毒性。相關論文以“Developing Inner Ear Organoids in Ultrasound-Activated Piezoelectric Hydrogel for Assessing Ototoxicity”為題，發(fā)表在ACS Nano上。

研究團隊首先對構建的BTO@GelMA水凝膠進行了系統(tǒng)表征。透射電子顯微鏡與X射線能譜分析顯示，BTO納米顆粒呈邊長約100納米的立方結構，且鈦、鋇、氧元素分布均勻。掃描電子顯微鏡圖像揭示了水凝膠內(nèi)部不規(guī)則、多孔且松散的網(wǎng)絡結構，這種結構有利于神經(jīng)元附著和神經(jīng)纖維生長。通過壓電響應力顯微鏡和二次諧波成像技術，研究人員證實了BTO@GelMA水凝膠具備優(yōu)異的壓電性能，其蝴蝶形振幅回線和180度相位變化清晰展現(xiàn)了壓電響應，而強烈的二次諧波信號則確認了BTO納米顆粒的非中心對稱晶體結構。在生物相容性方面，活死染色和EdU增殖實驗表明，在為期30天的超聲刺激下，水凝膠對類器官的細胞活力和增殖均無不良影響，且未誘導明顯的活性氧產(chǎn)生。值得注意的是，相比于被細胞內(nèi)吞的BTO納米顆粒會在超聲下產(chǎn)生活性氧，BTO@GelMA系統(tǒng)將壓電效應限制在細胞外環(huán)境，有效規(guī)避了潛在的氧化損傷風險。

圖1. (A) 示意圖，描繪了響應超聲刺激的壓電水凝膠介導的內(nèi)耳類器官中神經(jīng)元分化和成熟的促進作用。 (B) 在內(nèi)耳類器官中評估了順鉑的耳毒性影響以及白藜蘆醇的潛在耳保護作用，該模型可用于理解聽力損失的病理生理學機制及開發(fā)治療干預措施。

為探究BTO@GelMA結合超聲處理促進神經(jīng)元分化的機制，研究團隊對培養(yǎng)55天的類器官進行了轉(zhuǎn)錄組測序。結果顯示，與對照組相比，該處理組中差異表達基因范圍更廣，與神經(jīng)發(fā)生相關的基因（如SOX13）表達上調(diào)，而維持干性的基因（如PAX6）則下調(diào)。京都基因與基因組百科全書通路富集分析進一步揭示了突觸形成是該組上調(diào)基因富集的關鍵通路，而基因本體論富集分析則發(fā)現(xiàn)與鈣離子結合和離子通道活性相關的基因表達顯著上調(diào)，暗示鈣信號通路在超聲刺激下的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮著核心作用。

圖2. BTO@GelMA水凝膠的結構與活性評估。 (A) BTO納米顆粒的代表性透射電子顯微鏡和X射線能譜成像。 (B) 低倍和高倍放大下BTO@GelMA的掃描電子顯微鏡分析。 (C) BTO@GelMA區(qū)域的形貌圖像。 (D) BTO@GelMA的蝴蝶形振幅回線和相位滯后回線。 (E) 使用共振增強壓電響應力顯微鏡測量的BTO@GelMA的壓電響應。 (F) BTO@GelMA的二次諧波成像圖，較亮區(qū)域表示更強的二次諧波信號，較暗區(qū)域表示較弱的二次諧波強度。 (G) BTO@GelMA通過二次諧波成像的歸一化發(fā)射光譜。 (H) 不同處理后內(nèi)耳類器官中活性氧水平的測定。 (I, J) 第7天(I)和30天(J)內(nèi)耳類器官活性的活死染色圖像。 (K) 內(nèi)耳類器官的EdU增殖實驗結果。 (L) 活性氧水平的統(tǒng)計分析(n = 5)。 (M, N) 第7天和30天內(nèi)耳類器官存活率的分析(n = 5)。 (O) EdU實驗用于評估內(nèi)耳類器官的增殖能力(n = 5)。比例尺：50 nm (A)，20 μm (B)，1 μm (B中放大圖像)，10 μm (F)，200 μm (H–J)，100 μm (K)。NS，不顯著。

在功能驗證層面，研究團隊深入評估了壓電水凝膠對感覺神經(jīng)元分化和成熟的促進作用。明場圖像顯示，BTO@GelMA水凝膠中的類器官生長出更為密集的神經(jīng)網(wǎng)絡。qPCR和流式細胞術結果一致表明，Tuj1和MAP2等神經(jīng)元標志物的表達在BTO@GelMA聯(lián)合超聲處理組中顯著升高，且Tuj1陽性細胞比例增加。免疫熒光染色與三維重建圖像生動地展示了該處理組神經(jīng)元軸突更長、神經(jīng)網(wǎng)絡更復雜。更為重要的是，在該組中，髓鞘形成細胞標志物S100β陽性細胞緊密環(huán)繞著神經(jīng)絲蛋白NF200陽性的胞體和突起，且突觸標志物突觸素與突觸后密度蛋白95的共定位密度更高，提示壓電刺激促進了聽覺神經(jīng)元突觸的成熟。鈣成像記錄進一步證實，該組感覺神經(jīng)元表現(xiàn)出更高的鈣振蕩頻率和峰值幅度，表明神經(jīng)元網(wǎng)絡的自發(fā)電活動得到了增強。

圖3. BTO@GelMA聯(lián)合超聲加速神經(jīng)元分化與成熟。 (A) 封裝在水凝膠中30天的內(nèi)耳類器官的明場圖像。 (B, C) 在水凝膠中培養(yǎng)30天的內(nèi)耳類器官中Tuj1 (B) 和MAP2 (C) 的mRNA水平 (n = 3)。 (D) 內(nèi)耳類器官的三維重建，共染Tuj1和MAP2。 (E, F) 第55天TUJ1表達的流式細胞術及定量分析 (n = 3)。 (G) 水凝膠中培養(yǎng)30天，MAP2陽性區(qū)域的免疫組織化學染色。 (H) 基于圖像的第30天類器官中MAP2陽性區(qū)域的定量分析 (n = 5)。 (I, J) 內(nèi)耳類器官分別經(jīng)NF200、S100/PSD95和SYP染色的代表性共聚焦圖像。 (K) 水凝膠中培養(yǎng)55天的類器官鈣成像，顯示Fluo-4 AM熒光隨時間的動態(tài)波動。比例尺：500 μm (A)，300 μm (D, G)，50 μm (I–K)。*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01。

在確認壓電刺激促進神經(jīng)元分化的基礎上，研究團隊進一步驗證了類器官中耳蝸譜系細胞（如毛細胞）的存在與成熟。在第18天的細胞聚集體中，他們檢測到早期耳祖細胞標志物PAX8和PAX2的顯著上調(diào)，以及多能性標志物NANOG和OCT4的顯著下調(diào)，同時觀察到大量上皮突起共表達耳特異性標志物。透射電鏡圖像顯示，培養(yǎng)50天的類器官中出現(xiàn)帶有短微絨毛的未成熟毛細胞。到第80天，類器官內(nèi)部形成了囊泡結構，并分化出表達MYO7A、GATA3、SOX2和POU4F3等多種毛細胞標志物的上皮細胞，這些細胞頂部伸出富含F(xiàn)-肌動蛋白的靜纖毛束。更重要的是，在部分毛細胞中觀察到了與突觸素陽性點相鄰的CTBP2陽性點，提示形成了帶狀突觸樣結構。同時，研究還發(fā)現(xiàn)了雙極神經(jīng)元和含有軟骨細胞的軟骨樣結構，表明該內(nèi)耳類器官已形成了連接感覺神經(jīng)元和毛細胞的功能性感覺神經(jīng)回路。

圖4. BTO@GelMA系統(tǒng)中的內(nèi)耳類器官含有耳祖細胞和成熟的前庭毛細胞。 (A–D) 第18天細胞聚集體中耳特異性標志物和增殖標志物的免疫染色。 (E) 第50天內(nèi)耳類器官的透射電子顯微鏡圖像。 (F) 第80天獲得的具有明顯厚度和腔體的定型上皮的代表性圖像。 (G) qPCR數(shù)據(jù)顯示第80天內(nèi)耳類器官和人誘導多能干細胞中與成熟毛細胞和纖毛相關基因的表達 (n = 3)。 (H–K) 第80天內(nèi)耳類器官的代表性冰凍切片，顯示表達MYO7A、POU4F3和GATA3的毛細胞，而神經(jīng)元由TUJ1標記。富含F(xiàn)-肌動蛋白的毛束從毛細胞向外延伸。 (L, M) 第80天內(nèi)耳類器官的代表性冰凍切片，顯示CTBP2+斑點與MYO7A+細胞及SYP+斑點的共定位。 (N) 內(nèi)耳類器官中細胞組分分布示意圖。比例尺：100 μm (A–D)，500 μm (E, F)，50 μm (H–M)，10 μm (L–M中放大圖像)。P ≤ 0.05，P ≤ 0.01，P ≤ 0.001，****P ≤ 0.0001。

利用這一高度仿生的模型，研究團隊評估了白藜蘆醇對順鉑誘導的內(nèi)耳損傷的保護作用。流式細胞術與熒光染色結果顯示，順鉑處理會導致類器官內(nèi)活性氧水平顯著升高，超氧化物歧化酶水平下降，并誘導線粒體膜電位去極化、線粒體嵴丟失和皺縮等典型凋亡特征。而白藜蘆醇預處理能有效逆轉(zhuǎn)這些效應，降低活性氧和線粒體活性氧水平，恢復超氧化物歧化酶活性，并維持線粒體膜電位的完整性。此外，白藜蘆醇還能顯著減少順鉑誘導的毛細胞和神經(jīng)元凋亡。進一步的機制探索表明，白藜蘆醇能顯著下調(diào)鐵死亡相關基因Aim2和GPX4的表達，并減少細胞內(nèi)亞鐵離子的積累，提示其保護作用可能與抑制鐵死亡途徑有關。

圖5. 白藜蘆醇對順鉑誘導的內(nèi)耳類器官線粒體損傷的影響。 (A, B) 采用流式細胞術評估DCFH-DA平均熒光強度的變化 (n = 3)。 (C) 白藜蘆醇對順鉑誘導的內(nèi)耳類器官中超氧化物歧化酶水平的影響 (n = 3)。 (D) 透射電子顯微鏡圖像顯示對照組細胞的超微結構特征，以及暴露于順鉑及順鉑聯(lián)合白藜蘆醇的內(nèi)耳類器官的凋亡形態(tài)學特征。 (E) 評估未處理組（對照）、僅順鉑處理組或順鉑聯(lián)合白藜蘆醇處理24小時的類器官中MitoSOX熒光強度 (n = 8)。 (F) 不同組間JC-1熒光強度的定量變化 (n = 8)。 (G) 共聚焦顯微鏡圖像顯示類器官中線粒體活性氧水平，如MitoSOX染色所示。 (H) 內(nèi)耳類器官經(jīng)JC-1染色的代表性熒光圖像。比例尺：0.5 μm (D)，300 μm (G, H)。P ≤ 0.05，***P ≤ 0.0001。

圖6. 白藜蘆醇保護順鉑誘導的神經(jīng)元和毛細胞凋亡。 (A, B) 通過流式細胞術檢測內(nèi)耳類器官中神經(jīng)元凋亡的TUJ1和Cleaved Caspase-3染色的典型圖像(A)及相應定量評估(B) (n = 3)。 (C, D) 內(nèi)耳類器官中TUNEL、Phalloidin和MYO7A免疫熒光染色的典型圖像(C)及定量評估(D) (n = 5)。 (E, F) 順鉑和白藜蘆醇處理的內(nèi)耳類器官中Aim2 (E) 和GPX4 (F) 的mRNA表達 (n = 3)。 (G, H) 順鉑和白藜蘆醇處理的類器官表面神經(jīng)元的定量分析(G)和FerroOrange熒光圖像(H) (n = 8)。比例尺：50 μm (C)，300 μm (H)。*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01，****P ≤ 0.0001。

綜上，該研究成功構建了一種基于BTO@GelMA的無線、生物安全的水凝膠系統(tǒng)，該系統(tǒng)能響應超聲產(chǎn)生電刺激，有效促進內(nèi)耳類器官中神經(jīng)元的功能性成熟，并成功模擬了包含毛細胞和感覺神經(jīng)元的復雜感覺回路。利用這一先進平臺，研究證實了白藜蘆醇能通過抑制線粒體活性氧產(chǎn)生和細胞凋亡，有效對抗順鉑誘導的耳毒性，展現(xiàn)出作為天然護耳制劑的巨大潛力。這一研究不僅為內(nèi)耳發(fā)育、疾病過程及藥物篩選提供了更具生理相關性的模型，也為探索傳統(tǒng)中藥成分在聽力保護中的應用開辟了新路徑。