伴隨預(yù)制食品和生鮮產(chǎn)品的流行和冷鏈物流技術(shù)的進(jìn)步，食品實(shí)現(xiàn)地理界限跨越，為消費(fèi)者飲食生活帶來多樣化選擇。但是，受熱變質(zhì)、冷鏈脫冷問題等引起的食品安全事件常有報(bào)道。時(shí)間-溫度指示標(biāo)簽（TTI）因其優(yōu)良的特性而被廣泛應(yīng)用于生鮮食品冷鏈溫度和貨架期監(jiān)測(cè)。

基于指示原理，TTI被分為物理型、化學(xué)型及生物型，其中生物型又可分為酶型和微生物型。目前，常見的酶型TTI有脂肪酶型、淀粉酶型、糖化酶型、漆酶型等。國際上開展的多項(xiàng)應(yīng)用于食品監(jiān)測(cè)的TTI以酶型居多。由于酶的天然特性，酶型TTI不僅可用于監(jiān)測(cè)食品的貯運(yùn)過程和貨架期，還可應(yīng)用于食品生產(chǎn)制作過程，如泡菜發(fā)酵、冷凍牛肉高溫解凍及方便杯面熟度指示等。不同酶型TTI的反應(yīng)機(jī)理如表1所示。

在酶型TTI的研發(fā)和制備過程中，所監(jiān)測(cè)產(chǎn)品的貯存條件和貨架期決定酶的可選種類。但是，絕大多數(shù)酶與所監(jiān)測(cè)產(chǎn)品在熱穩(wěn)定性上均存在偏差，需要進(jìn)一步調(diào)整。酶工程基于近現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)中的技術(shù)和手段研究并改變酶的生物學(xué)性質(zhì)，為提高酶熱穩(wěn)定性提供技術(shù)與手段。

清華大學(xué)工程物理系的彭華康、王垚*和北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科的張煥芝等人針對(duì)當(dāng)前酶工程提升酶熱穩(wěn)定性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并概述相關(guān)策略，以期為酶型TTI的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 酶固定化

固定化技術(shù)是酶工程的核心技術(shù)之一，該技術(shù)通過物理或化學(xué)手段將天然游離酶固定在特定載體上，一方面，可實(shí)現(xiàn)酶的回收利用，達(dá)到降本增效的目的；另一方面，能夠使酶在限定的空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高濃度聚集，同時(shí)維持其較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，不斷推動(dòng)生物催化和生物轉(zhuǎn)化的發(fā)展。在酶型TTI中應(yīng)用固定化酶，一方面可以提高酶的熱穩(wěn)定性，另一方面可以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的固態(tài)化，從而解決體系易泄漏造成污染、制備流程難以產(chǎn)線化的弊端。

固定化酶的制備方法包括吸附法、包埋法、共價(jià)法及交聯(lián)法，其中，包埋法在酶型TTI中的應(yīng)用最為廣泛。包埋法一般無需對(duì)酶進(jìn)行修飾或改性（保留酶的原有結(jié)構(gòu)），僅通過物理手段將酶嵌入高分子載體即可提高酶的富集度、活性和穩(wěn)定性。包埋法分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法，所用材料均為生物大分子，如聚乙烯醇（PVA）、海藻酸鈉、殼聚糖等。崔子杰等采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法探討微膠囊法制備固態(tài)脂肪酶型TTI的最佳配比策略，優(yōu)化后的脂肪酶微膠囊制備工藝顯著提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性和耐堿性，有效拓寬脂肪酶型TTI的應(yīng)用范圍。Xu Fengjuan等以酪氨酸酶為原料，通過PVA凝膠包埋法制備固態(tài)酶型TTI，由于酶的穩(wěn)定性和催化活性提升，該TTI的監(jiān)測(cè)時(shí)長可達(dá)50.48 h。酶熱穩(wěn)定性的提高不僅可以延長酶型TTI的監(jiān)測(cè)時(shí)長，還可以提高監(jiān)測(cè)準(zhǔn)確性。如采用海藻酸鈉包埋法制備的固態(tài)糖化酶型和淀粉酶型TTI能夠在變溫條件下準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)酸奶和冷鮮豬肉品質(zhì)變化。

固定化技術(shù)可顯著改善液態(tài)酶型TTI易泄漏和不穩(wěn)定的問題，但固態(tài)酶型TTI目前尚未達(dá)到可工業(yè)化應(yīng)用的地步。由于包埋材料的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，酶促反應(yīng)底物和產(chǎn)物會(huì)出現(xiàn)難以擴(kuò)散的問題，影響酶促效率。此外，酶和底物難以自由擴(kuò)散，同時(shí)，盡管固定化技術(shù)一定程度上提升了酶的穩(wěn)定性，但是載體材料形成的微環(huán)境對(duì)酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)仍有影響。為解決這些難題，一方面可從優(yōu)化現(xiàn)有酶反應(yīng)體系和包埋方案、制備復(fù)合固定化酶型TTI、提升TTI的穩(wěn)定性方面入手；另一方面可從優(yōu)化與開發(fā)固定化材料如納米材料、高比表面積材料和電紡材料等方面切入，例如，相比于殼聚糖，電紡殼聚糖作為固定化載體可以進(jìn)一步延長漆酶型TTI的監(jiān)測(cè)時(shí)效，且整體指示反應(yīng)更均勻，適用于更多種類的食品監(jiān)測(cè)。

2 酶改造

相較于固定化，酶改造往往會(huì)帶來更大的收益，但是酶改造技術(shù)在酶型TTI上的應(yīng)用還比較少見。酶改造分為定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)。

2.1 酶的定向進(jìn)化

定向進(jìn)化是一種在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬自然進(jìn)化過程的技術(shù)。研究人員通過在體外環(huán)境中引入隨機(jī)突變和基因重組創(chuàng)造出大量蛋白質(zhì)變體；然后，根據(jù)需求和目標(biāo)人為施加定向選擇壓力以篩選出具有所需特性的蛋白質(zhì)（如酶），從而在分子層面上實(shí)現(xiàn)進(jìn)化的模擬。在酶型TTI中常用的酶為脂肪酶和糖化酶，定向進(jìn)化是提升其穩(wěn)定性的主要途徑。

定向進(jìn)化是在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制未知的情況下引入大量突變以隨機(jī)獲取目標(biāo)特性，因此，定向進(jìn)化的成功率高度依賴突變庫的多樣性和篩選的高通量。一個(gè)成功的突變庫不僅可以提高定向進(jìn)化成功率，同時(shí)還能簡(jiǎn)化定向進(jìn)化進(jìn)程。建立基因突變庫的工具和技術(shù)主要包括DNA重組、易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（epPCR）、正交DNA復(fù)制系統(tǒng)（OrthoRep）、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）及其關(guān)聯(lián)蛋白（Cas）（CRISPR/Cas）系統(tǒng)和連續(xù)定向進(jìn)化（CDE）等。

DNA重組是一種可有效對(duì)單基因或同源基因進(jìn)行隨機(jī)突變的體外重組技術(shù)。嗜熱脂肪芽孢桿菌

-淀粉酶和杜邦嗜熱菌（

Thermomyces dupontii

）脂肪酶經(jīng)過DNA重組后的熱穩(wěn)定性分別提升5 倍和2 倍。相較于固定化，DNA重組可以在不損失酶活性的情況下顯著提升其熱穩(wěn)定性。

DNA聚合酶在特定條件下會(huì)出現(xiàn)高頻率錯(cuò)配，可利用這個(gè)特征在目的基因中引入隨機(jī)突變?；诖嗽?，epPCR在1989年由Leung等提出。王亞偉等利用該方法分別將

-高甘露聚糖酶ManB的最適反應(yīng)溫度和熔解溫度（

T

m ）提高5 ℃和1.3 ℃。相較于epPCR，Chen Keqin等開發(fā)的多重epPCR和Shao Weilan等開發(fā)的原位epPCR可以實(shí)現(xiàn)更便捷的轉(zhuǎn)化和篩選，顯著減少后續(xù)篩選工作量，同時(shí)允許多輪突變累積，在獲得多個(gè)改進(jìn)特性的突變體方面非常有優(yōu)勢(shì)。

單一突變的篩選與檢測(cè)往往無法得到符合理想特性的酶。定點(diǎn)突變（SSM）是定向進(jìn)化最常用的策略，該策略通過將飽和突變技術(shù)、epPCR、DNA重組等技術(shù)組合使用，快速實(shí)現(xiàn)有義突變累積，提高脂肪酶對(duì)映體選擇性。但是，SSM的突變效率低、基因突變庫缺乏多樣性，往往需要經(jīng)過多輪突變和篩選才能獲得理想特性。隨后，寡核苷酸飽和突變和多位點(diǎn)飽和突變等飽和突變技術(shù)的提出實(shí)現(xiàn)了基因突變庫的多樣性，保證了突變庫的合理與完整。

OrthoRep是一種由Liu Chang團(tuán)隊(duì)開發(fā)的體內(nèi)隨機(jī)突變技術(shù)，突變率比染色體基因組突變高10萬 倍。OrthoRep主要基于由1 個(gè)位于釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)中的含有目標(biāo)基因的末端蛋白質(zhì)粒和1 個(gè)靶向末端蛋白的DNA聚合酶組成的正交靶向系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的快速連續(xù)突變，且不影響染色體基因組的正常擴(kuò)增。值得注意的是，OrthoRep編碼基因的表達(dá)強(qiáng)度會(huì)受其組成元件的調(diào)控；啟動(dòng)子優(yōu)化、poly(A)尾修飾及p2質(zhì)粒等多種方案可進(jìn)一步提升OrthoRep的實(shí)用性和表達(dá)強(qiáng)度。例如，García-García等通過OrthoRep提升THI4噻唑合酶在植物細(xì)胞中的催化效率和穩(wěn)定性，以更好適應(yīng)植物的生長發(fā)育。

細(xì)胞存在2 種DNA修復(fù)機(jī)制，即同源引導(dǎo)修復(fù)和非同源末端連接（NHEJ），其中NHEJ是體內(nèi)產(chǎn)生突變的主要來源。研究者們利用CRISPR/Cas9技術(shù)在特定的DNA序列處引發(fā)一個(gè)具有定位性的雙鏈斷裂，并基于NHEJ開發(fā)了EvlovR、CRISPR-X和CasPER等CDE系統(tǒng)。EvlovR由Halperin等開發(fā)，并經(jīng)過Hu等的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了前間隔序列鄰近基序的范圍拓展。CRISPR-X由Hess等開發(fā)，可以通過一次轉(zhuǎn)化突變多個(gè)基因組位點(diǎn)，將綠色熒光蛋白定向進(jìn)化為增強(qiáng)綠色熒光蛋白。CasPER系統(tǒng)整合了CRISPR/Cas9和epPCR，可以將大型供體突變體文庫整合至多個(gè)基因組位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)高效率和高通量的進(jìn)化研究，成功率高達(dá)99%。

高質(zhì)量突變體庫可以在一定程度上提高篩選效率。但是，隨著擬突變位點(diǎn)數(shù)目的增加，需要篩選的范圍和復(fù)雜度也急劇增加。每個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸突變均有20 種可能，每突變

X

個(gè)位點(diǎn)，則需要篩選的突變體庫為20

X

，篩選工作量巨大且復(fù)雜。高通量篩選技術(shù)不僅可以節(jié)約時(shí)間和成本，還能夠顯著提高獲得所需特性突變體的機(jī)率。平板篩選法、微孔板法、流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)、液滴微流控技術(shù)等均是目前常用的篩選技術(shù)，分選數(shù)量級(jí)為10 4 ～10 9 。流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)和液滴微流控技術(shù)主要通過酶活進(jìn)行篩選，因此，更加適合進(jìn)行酶的高通量篩選。巖藻糖苷酶、辣根過氧化物酶、羧酸酯酶、糖苷酶等均可通過這2 種方案進(jìn)行篩選。

廣泛應(yīng)用于多肽和抗體篩選的噬菌體展示技術(shù)也可用于酶突變庫的高通量篩選。堿性磷酸酶在噬菌體表面的有效催化證明了該技術(shù)在酶突變庫高通量篩選中的應(yīng)用潛力。噬菌體展示技術(shù)、噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)、細(xì)菌表面展示技術(shù)和酵母表面展示技術(shù)等均是極為成功的高通量篩選技術(shù)，其篩選量級(jí)為107～109。

2.2 酶的理性設(shè)計(jì)

定向進(jìn)化為人工提高酶的熱穩(wěn)定性提供了一種不可替代的方法，也使人們意識(shí)到蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的重要性。但是，突變庫建立和高通量篩選仍然具有許多問題。結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展及X射線晶體學(xué)、核磁共振和冷凍電子顯微鏡等分辨率技術(shù)的進(jìn)步為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析提供可能，由此拉開了理性設(shè)計(jì)的大門。

2.2.1 基于結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性相關(guān)的理性設(shè)計(jì)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，越來越多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能被解析，基于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過對(duì)特定功能位點(diǎn)進(jìn)行改造的（半）理性設(shè)計(jì)應(yīng)運(yùn)而生。相較于定向進(jìn)化，酶的（半）理性設(shè)計(jì)主要目的是有目的性、精準(zhǔn)地通過定點(diǎn)突變和片段插入/刪除等操作獲得期望或具有新穎特性的酶突變體，可大量精簡(jiǎn)突變體庫規(guī)模及篩選操作量。（半）理性設(shè)計(jì)需要對(duì)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)有深入的了解。與半理性設(shè)計(jì)最大的區(qū)別在于，理性設(shè)計(jì)更強(qiáng)調(diào)酶的突變方向，即已知突變與功能的聯(lián)系。

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、功能位點(diǎn)均與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性高度相關(guān)。早在1986年，Bryan等通過分析發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定枯草桿菌蛋白酶擁有更好的氫鍵參數(shù)，即在三維結(jié)構(gòu)內(nèi)擁有更短的位點(diǎn)距離和更直接的位點(diǎn)連接。除氫鍵以外，鹽橋、芳環(huán)相互作用、疏水相互作用等非共價(jià)相互作用均在維持酶的構(gòu)象和穩(wěn)定性方面起著非常關(guān)鍵的作用。非共價(jià)相互作用可以給酶帶來更高的剛性（氫鍵和鹽橋）、更高的堆積效率（芳環(huán)相互作用）及更高的

-螺旋穩(wěn)定性（疏水相互作用），從而使酶具有更穩(wěn)定的構(gòu)象和更好的熱穩(wěn)定性。折疊和未折疊狀態(tài)之間的自由能差（Δ

G

）是決定酶熱穩(wěn)定性的另一重要因素。共價(jià)相互作用（二硫鍵）、特殊構(gòu)象氨基酸（甘氨酸、脯氨酸等）及亞基相互作用均可改變?chǔ)?blockquote id="4BJSIGTE">G。然而，酶表面區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)酶的熱穩(wěn)定性也非常重要。Arnold和Dong Chen等在酶的工程化改造過程中發(fā)現(xiàn)，許多酶活性口袋之外位點(diǎn)的改造也能夠提升酶的熱穩(wěn)定性。糖蛋白表面的糖鏈序列（糖基化）、末端環(huán)化序列等表面結(jié)構(gòu)往往也決定著蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。不影響蛋白質(zhì)折疊和構(gòu)象的糖基化可以增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性，而天然糖基化位點(diǎn)的消除一般會(huì)導(dǎo)致酶不穩(wěn)定。糖基化工程是目前應(yīng)用于改善酶熱穩(wěn)定性的新方法。

Reetz等提出的組合活性中心飽和突變策略（CAST）和迭代飽和突變技術(shù)極大精簡(jiǎn)了突變體庫規(guī)模，提高了篩選效率。CAST方案廣泛應(yīng)用于改進(jìn)酶的立體選擇性、區(qū)域選擇性、底物范圍和催化效率等關(guān)鍵參數(shù)，這標(biāo)志著酶工程從非理性設(shè)計(jì)向半理性設(shè)計(jì)的重要轉(zhuǎn)變。此后，序列飽和突變技術(shù)、蛋白進(jìn)化路徑重建分析、集中理性迭代定點(diǎn)誘變策略、多重序列三維比對(duì)策略、蛋白質(zhì)序列-活性相關(guān)性進(jìn)化策略、基于體內(nèi)同源序列的誘變重組技術(shù)及三密碼子飽和突變策略等技術(shù)的提出標(biāo)志著酶的理性設(shè)計(jì)逐漸成熟。研究者們可以通過這些技術(shù)構(gòu)建“小而精”的突變體庫，用于酶熱穩(wěn)定性的定向改造，大大降低篩選工作量。

2.2.2 基于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的理性設(shè)計(jì)

傳統(tǒng)的理性設(shè)計(jì)常采用多序列比對(duì)與蛋白結(jié)構(gòu)分析相結(jié)合，找到與熱穩(wěn)定性相關(guān)的潛在位點(diǎn)，再通過濕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。Chopra等通過該方法獲取了熱穩(wěn)定性更高的脂肪酶。與傳統(tǒng)理性設(shè)計(jì)（

T

m 提高小于15 ℃）相比，通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的理性設(shè)計(jì)可以獲得熱穩(wěn)定性更高的突變體（

T

m 提高超過35 ℃以上）。

隨著計(jì)算生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的進(jìn)步，借助于高性能計(jì)算機(jī)的大數(shù)據(jù)計(jì)算能力對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全面模擬和預(yù)測(cè)變得更加精確，這為指導(dǎo)酶熱穩(wěn)定性改造提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?；谟?jì)算機(jī)輔助技術(shù)，采用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、量子力學(xué)計(jì)算、蒙特卡羅方程法和模擬退火等多種計(jì)算方法，可通過虛擬實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)并評(píng)估突變體在結(jié)構(gòu)、自由能、底物結(jié)合能等方面的變化。通過這一循環(huán)迭代過程，研究人員能夠篩選出具有期望特性的酶，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些預(yù)測(cè)結(jié)果。與傳統(tǒng)理性設(shè)計(jì)相比，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)可運(yùn)用計(jì)算機(jī)解決絕大多數(shù)工作，大大節(jié)省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)；此外，大量的數(shù)據(jù)庫可為后續(xù)相同特性的酶設(shè)計(jì)提供計(jì)算模板。目前，在蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計(jì)、酶的催化效率和熱穩(wěn)定性提高等領(lǐng)域已經(jīng)取得一系列顯著成就，其中一些成果已達(dá)到可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的水平。

計(jì)算軟件和計(jì)算策略的進(jìn)步有效提高了酶的改造效率。2003年，華盛頓大學(xué)的Leaver-Fay等開發(fā)的Rosetta軟件如今已發(fā)展為集蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)、酶活性中心設(shè)計(jì)、配體對(duì)接、生物大分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等功能為一體的生物大分子計(jì)算建模與分析軟件組合。此后的計(jì)算策略大多基于Rosetta軟件設(shè)計(jì)策略。在熱穩(wěn)定性改造方面，由荷蘭格羅寧根大學(xué)的Wijma等提出的FRESCO策略應(yīng)用最為廣泛。FRESCO策略采用Rosetta等多種計(jì)算軟件預(yù)測(cè)能提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的單點(diǎn)突變，并利用分子動(dòng)力學(xué)模擬篩選突變方案的可行性，再通過濕實(shí)驗(yàn)篩選出熱穩(wěn)定性提高的突變體，最后將一部分單點(diǎn)突變疊加，獲得熱穩(wěn)定性大幅提高的多點(diǎn)突變體。該團(tuán)隊(duì)利用FRESCO策略分別將檸檬烯環(huán)氧化物水解酶和鹵代烷脫鹵酶LinB的

T

m 提高35 ℃和23 ℃。2016年，中國科學(xué)院微生物研究所的研究團(tuán)隊(duì)與荷蘭格羅寧根大學(xué)及Enzypep公司攜手，運(yùn)用一種結(jié)合FRESCO與一致性分析的計(jì)算策略對(duì)多肽酰胺酶進(jìn)行深入的工程化改造，成功開發(fā)出一種包含12 個(gè)關(guān)鍵突變位點(diǎn)的多肽酰胺酶突變體，并命名為PMA12A；PAM12A展現(xiàn)出卓越的熱穩(wěn)定性，其

T

m 高達(dá)76 ℃，并且能夠在乙腈、丙酮等無水溶劑中維持?jǐn)?shù)天的穩(wěn)定活性。此外，由Diaz等開發(fā)的基于計(jì)算統(tǒng)計(jì)的輔助設(shè)計(jì)策略可以使馬兜鈴烯合成酶的

T

m提高45 ℃。Goldenzweig等通過聯(lián)合計(jì)算策略，將乙酰膽堿酯酶突變體的熱穩(wěn)定性相較于野生型提高20 ℃。

近年來，人工智能（AI）輔助的酶分子改造技術(shù)在理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化上取得巨大成功；AI技術(shù)通過數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的方式構(gòu)建序列/結(jié)構(gòu)-酶性能的預(yù)測(cè)模型，挑選優(yōu)良突變酶，提高酶分子改造效率。AI利用機(jī)器學(xué)習(xí)模型、深度學(xué)習(xí)模型和數(shù)據(jù)庫開發(fā)學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)序列、共進(jìn)化信息和結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的酶活性表征和預(yù)測(cè)，從而預(yù)測(cè)有益突變，優(yōu)化酶的熱穩(wěn)定性，提高催化活性。在AI輔助的酶工程研究中，研究者們僅需根據(jù)機(jī)器提供的突變體信息進(jìn)行濕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證即可得到期望的酶突變體。傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)的常見算法包括線性模型、隨機(jī)森林、支持向量機(jī)、高斯過程等，其中，隨機(jī)森林和高斯過程算法提供多種酶熱穩(wěn)定性改造實(shí)例，由P450 Diffusion方法生成的P450酶具有更好的酶活性和熱穩(wěn)定性，催化能力提升1.3～3.5 倍。與傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)不同，深度學(xué)習(xí)算法的邏輯更類似人類大腦，會(huì)進(jìn)行由低到高的特征學(xué)習(xí)及分層處理，不依賴于人工數(shù)據(jù)喂養(yǎng)，可以學(xué)習(xí)并展現(xiàn)更多基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的隱藏信息，深刻變革了機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域。目前已有利用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的相關(guān)報(bào)道。由Deepmind公司開發(fā)的AlphaFold是深度學(xué)習(xí)在結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)領(lǐng)域十分成功的案例，其參與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)評(píng)估全球競(jìng)賽的43 個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，有25 個(gè)獲得最高分。AlphaFold的出現(xiàn)為很多不具備結(jié)構(gòu)解析條件的實(shí)驗(yàn)室提供了另一種理性設(shè)計(jì)方案，加速了酶進(jìn)化的步伐。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)旨在了解現(xiàn)有的酶，深度學(xué)習(xí)算法還為從頭設(shè)計(jì)自然界不存在的新酶提供了可能。AI深度學(xué)習(xí)算法可以從模型和數(shù)據(jù)庫中獲取結(jié)構(gòu)信息以外的未知信息，提供與現(xiàn)有從頭設(shè)計(jì)思路完全不同的酶設(shè)計(jì)方法，中國科學(xué)院微生物研究所的吳邊團(tuán)隊(duì)使用深度學(xué)習(xí)算法構(gòu)建了一系列新型酶蛋白，實(shí)現(xiàn)了自然界未曾發(fā)現(xiàn)的催化反應(yīng)，并通過完全的計(jì)算指導(dǎo)獲得工業(yè)級(jí)微生物工程菌株，推動(dòng)

-氨基酸的高效、綠色合成。由聚樹生物與清華大學(xué)深圳國際研究生院合作開發(fā)的DLKcat模型和GotEnzymes數(shù)據(jù)庫能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的酶活性表征，只需輸入底物信息和酶的蛋白質(zhì)序列，便能得到遠(yuǎn)多于數(shù)據(jù)庫中收集的、具體的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為深度學(xué)習(xí)模型提供精確和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)酶設(shè)計(jì)領(lǐng)域的數(shù)據(jù)-模型飛輪效應(yīng)。此外，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的autoHIPPS系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量“新酶序列”篩選，為AI酶參數(shù)預(yù)測(cè)提供大量高質(zhì)量數(shù)據(jù)，顯著提升AI模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和效率。

盡管計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)在酶工程領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力，但是其進(jìn)一步應(yīng)用仍需克服預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性、數(shù)據(jù)質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、蛋白質(zhì)序列空間巨大、活性位點(diǎn)設(shè)計(jì)難度、穩(wěn)定性和表達(dá)水平、多目標(biāo)優(yōu)化及深度學(xué)習(xí)模型局限性等多方面的挑戰(zhàn)。

3 不同酶改造策略的優(yōu)勢(shì)和局限性

熱穩(wěn)定性是影響酶型TTI應(yīng)用和推廣的最主要因素，其不僅影響酶型TTI的監(jiān)測(cè)準(zhǔn)確性，還影響酶型TTI的形態(tài)、貯運(yùn)及適用范圍。傳統(tǒng)的酶工程往往通過物理或化學(xué)交聯(lián)提高酶的熱穩(wěn)定性，酶型TTI中的常用方式也基于此。但這些方案存在較大局限性，如安全性、酶活性、產(chǎn)品形態(tài)等（表2）。

固定化技術(shù)不僅能提升酶的回收率，還能顯著提高酶的熱穩(wěn)定性。現(xiàn)有的固定化載體材料雖然能夠增加酶的熱穩(wěn)定性，但往往會(huì)導(dǎo)致酶活性位點(diǎn)（活性口袋）的限位，從而降低酶活性。此外，不同的固定化方案對(duì)酶熱穩(wěn)定性的提升效率不一致，這會(huì)增加酶型TTI熱力學(xué)擬合的工作量。近年來出現(xiàn)的一些新型載體材料不僅可以提供更完備的包埋方案，還能夠保證酶與底物的充分接觸，不會(huì)降低酶的活性。隨著生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)及材料學(xué)的進(jìn)一步交叉，相信會(huì)有越來越多的新型載體材料被應(yīng)用于酶的固定化中。綜合當(dāng)下材料的缺陷，酶型TTI中應(yīng)用新型固定化材料應(yīng)進(jìn)行更理性的設(shè)計(jì)。例如，充分考慮酶的結(jié)構(gòu)變化，保證酶與底物充分接觸；在材料內(nèi)部適當(dāng)引入活性基團(tuán)，保證酶反應(yīng)環(huán)境的穩(wěn)定性；充分考慮工業(yè)成本，使用更簡(jiǎn)便的方案和易獲取的材料進(jìn)行聚合和固定化。此外，酶型TTI產(chǎn)品形態(tài)也顯著影響其應(yīng)用范圍，紙基化的開發(fā)是今后酶型TTI發(fā)展的主要趨勢(shì)，新型固定化材料的研發(fā)將會(huì)顯著推進(jìn)酶型TTI紙基化的發(fā)展路徑。

酶的定向進(jìn)化和結(jié)構(gòu)修飾是另外一種提升酶熱穩(wěn)定性的方案。定向進(jìn)化技術(shù)在不依賴于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制等詳細(xì)信息的情況下，雖然能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)功能的優(yōu)化，但常常面臨篩選效率瓶頸；半理性設(shè)計(jì)方法則在一定程度上平衡了序列空間多樣性和篩選工作量，通過結(jié)合一些已知的生物學(xué)信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)改造；相比之下，理性設(shè)計(jì)則基于深入的分子機(jī)制理解創(chuàng)造出自然界中不存在的新型酶和催化反應(yīng)，從而拓展生物催化的應(yīng)用范圍。酶型TTI作為一種工業(yè)化方案，在實(shí)際應(yīng)用中更需要考慮技術(shù)的成熟性和成本。在開展具體的酶修飾案例時(shí)，應(yīng)充分考慮各項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，結(jié)合實(shí)際需求和應(yīng)用成本進(jìn)行改造。單一的特性改造和篩選并不會(huì)顯著增加定向進(jìn)化的工作量和復(fù)雜程度，因此，定向進(jìn)化目前仍然是酶型TTI產(chǎn)業(yè)中最主要的熱穩(wěn)定性改造方案。隨著（半）理性設(shè)計(jì)的進(jìn)一步成熟，酶的改造和設(shè)計(jì)將更加簡(jiǎn)便、成本更低。

隨著生物信息學(xué)和計(jì)算生物學(xué)的發(fā)展，酶的理性設(shè)計(jì)和從頭設(shè)計(jì)越來越簡(jiǎn)便。干-濕實(shí)驗(yàn)結(jié)合將是未來酶工程工作者的主要工作模式。計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和機(jī)器學(xué)習(xí)將會(huì)替代并優(yōu)化眾多反復(fù)的篩選工作。同時(shí)，由于數(shù)據(jù)庫的建立和擴(kuò)大，機(jī)器學(xué)習(xí)將可能提供完全不同于現(xiàn)今工作路徑的新酶發(fā)現(xiàn)方案。

結(jié) 語

酶型TTI能通過顏色變化直觀反映食品的全程溫度變化并指示保質(zhì)期，但由于酶固有的熱穩(wěn)定性問題，其應(yīng)用與工業(yè)推廣受貯藏條件、監(jiān)測(cè)精度等限制。酶工程策略的單一或綜合應(yīng)用可以克服酶型TTI熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。但是，酶工程策略均存在自身局限性，未來需整合跨學(xué)科技術(shù)以優(yōu)化現(xiàn)有方法，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、高效的酶性能改造，促進(jìn)酶型TTI的推廣和應(yīng)用。酶型TTI的發(fā)展瓶頸不僅在于熱穩(wěn)定性，更在于其單一的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。伴隨著食品行業(yè)的發(fā)展和生活水平的提高，消費(fèi)者將會(huì)更關(guān)注食品的新鮮度、口感等多種維度，因此，需要對(duì)酶進(jìn)行更多特性的改造或從頭設(shè)計(jì)，以使其符合消費(fèi)者的需求。機(jī)器學(xué)習(xí)將有極大可能設(shè)計(jì)出能夠催化多種專一反應(yīng)的酶以監(jiān)測(cè)多個(gè)指標(biāo)，這將進(jìn)一步拓寬酶型TTI應(yīng)用范圍，促進(jìn)酶型TTI的推廣和應(yīng)用。

引文格式：

彭華康, 張煥芝, 王晨躍, 等. 提升酶型時(shí)間-溫度指示器熱穩(wěn)定性的酶工程策略研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(10): 378-386. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240703-041.

PENG Huakang, ZHANG Huanzhi, WANG Chenyue, et al. Research progress in enzyme engineering strategies to improve the thermal stability of enzymatic time-temperature indicators[J]. Food Science, 2025, 46(10): 378-386. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240703-041.

實(shí)習(xí)編輯：普怡然 ；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)。

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