抗菌素耐藥性（AMR）的快速出現(xiàn)已成為當(dāng)今最緊迫的全球公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一，這使得傳統(tǒng)抗生素對多種病原菌逐漸失效。尤其令人擔(dān)憂的是革蘭氏陰性菌，如銅綠假單胞菌，這種高優(yōu)先級病原體因其固有的耐藥機制（如低外膜滲透性和高表達外排泵）而臭名昭著，是免疫功能低下患者（如囊性纖維化患者）呼吸道感染的主要致病菌。根據(jù)2022年CHINET報告，它在臨床呼吸道病原體中名列前茅。盡管β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物是當(dāng)前治療銅綠假單胞菌感染的主要手段，但耐藥性的發(fā)展嚴重損害了其療效。更嚴峻的是，自1980年代以來，針對革蘭氏陰性菌的新型抗生素開發(fā)進展甚微，這使得優(yōu)化現(xiàn)有抗生素療效的策略變得迫在眉睫。

針對上述挑戰(zhàn)，北京化工大學(xué)徐福建教授、趙娜娜教授與張凱副教授團隊提出并展示了一種仿生納米平臺（Ce-Car@EV NPs）。該平臺通過合理整合姜來源的細胞外囊泡（EVs）和pH響應(yīng)性的鈰-羧芐青霉素配位納米顆粒（Ce-Car NCPs）構(gòu)建而成。這種設(shè)計實現(xiàn)了納米顆粒在體內(nèi)的長效循環(huán)，并能在酸性的感染部位特異性降解，從而釋放出Ce??離子和羧芐青霉素。釋放的Ce??離子能穿透細菌細胞，通過破壞ATP合成、阻礙氧化磷酸化并抑制外排泵活性來干擾細菌的能量代謝。通過耗竭ATP并阻斷外排泵，Ce??離子作為羧芐青霉素的強效佐劑，成功地逆轉(zhuǎn)了細菌耐藥性。研究團隊在體內(nèi)外證實，該策略能有效恢復(fù)羧芐青霉素對耐藥銅綠假單胞菌的殺菌效力，為利用金屬佐劑對抗抗菌素耐藥性建立了一種新的治療范式。相關(guān)論文以“Biomimetic metal-drug coordination nanoplatform to counteract drug resistance in Pseudomonas aeruginosa via energy disruption”為題，發(fā)表在

Nature Communications

研究團隊首先通過一鍋法自組裝成功制備了Ce-Car NCPs，隨后通過超聲處理將其封裝在姜來源的EVs中，形成Ce-Car@EV NPs。透射電鏡圖像清晰顯示，約10 nm的Ce-Car NCPs被成功包裹在典型的碟形EVs內(nèi)部，XPS、FTIR及分子軌道模擬等多種表征手段證實了Ce(IV)與羧芐青霉素之間的成功配位以及EVs的成功包覆。更重要的是，體外釋放研究表明，在模擬感染微環(huán)境的酸性條件（pH 5.5）下，該納米平臺在12小時內(nèi)釋放了超過70%的羧芐青霉素，而在生理條件（pH 7.4）下釋放量不足15%，展現(xiàn)出了優(yōu)異的pH響應(yīng)控制釋放能力。進一步的分子對接模擬顯示，Ce(IV)的存在不僅能通過靜電吸引增強羧芐青霉素與其靶標(biāo)蛋白PBP3的結(jié)合力（結(jié)合能從-6.93 kcal/mol降至-7.84 kcal/mol），還能穩(wěn)定藥物-蛋白復(fù)合物，從而協(xié)同增強抗菌效果。

圖1. 仿生Ce-Car@EVs納米平臺示意圖：用于在小鼠肺炎模型中對抗耐藥銅綠假單胞菌感染，該平臺具有高細胞內(nèi)抗生素滯留和體內(nèi)長循環(huán)的特性。

圖2. Ce-Car@EV NPs的制備與表征。 a Ce-Car@EV NPs的制備流程示意圖。 b Ce-Car NCPs、G-EVs和Ce-Car@EV NPs的透射電鏡圖像。 c Ce-Car NCPs的最高占據(jù)分子軌道（HOMO）和最低未占分子軌道（LUMO）的局部電荷密度圖。 d Car和Ce-Car NCPs的傅里葉變換紅外光譜。 e Ce-Car NCPs、G-EVs和Ce-Car@EV NPs的Zeta電位。 f Ce-Car@EV NPs在pH 5.5和7.4的Tris-HCl緩沖液中的Car釋放曲線。 g G-EVs和Ce-Car@EV NPs的SDS-PAGE蛋白分析。 h 在無Ce(IV)情況下，Car與青霉素結(jié)合蛋白3（PBP3）結(jié)合的分子對接模擬。 i 在有Ce(IV)情況下，Car與PBP3結(jié)合的分子對接模擬。

體外抗菌實驗證實了這種pH響應(yīng)性帶來的優(yōu)勢。在pH 5.5的酸性環(huán)境下，32 μg/mL的Ce-Car@EV NPs能殺滅96.81%的銅綠假單胞菌，而在pH 7.4時細菌存活率仍高于80%?；?死細菌染色和掃描電鏡圖像也直觀地顯示，只有在酸性條件下經(jīng)Ce-Car@EV NPs處理的細菌才出現(xiàn)大量死亡和嚴重的結(jié)構(gòu)變形。棋盤稀釋法驗證了Ce(IV)與羧芐青霉素的協(xié)同作用（FICI指數(shù)為0.5）。更為關(guān)鍵的是，在連續(xù)傳代30次的耐藥性誘導(dǎo)實驗中，游離羧芐青霉素處理組的最低抑菌濃度（MIC）飆升了256倍，而Ce-Car@EV NPs處理組則顯著延遲且降低了耐藥性的產(chǎn)生。對于已產(chǎn)生的耐藥菌，Ce-Car@EV NPs在16 μg/mL的濃度下就能將其殺滅，而游離羧芐青霉素在高達2048 μg/mL時仍效果不佳。

圖3. Ce-Car@EV NPs的體外抗菌性能。 a 在pH 5.5和7.4條件下，不同濃度Ce-Car@EV NPs處理2小時后標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌的活力。 b 不同pH條件下，經(jīng)Ce-Car@EV NPs處理后的銅綠假單胞菌活/死染色。 c 不同pH條件下，經(jīng)Ce-Car@EV NPs處理后銅綠假單胞菌的掃描電鏡圖像。 d Car和Ce(IV)聯(lián)合抗銅綠假單胞菌的棋盤稀釋法協(xié)同效應(yīng)分析。 e 經(jīng)Ce-Car@EV NPs誘導(dǎo)30代后，銅綠假單胞菌對Car的耐藥性發(fā)展。 f Car和Ce(IV)聯(lián)合抗耐藥銅綠假單胞菌的棋盤稀釋法協(xié)同效應(yīng)分析。 g Car和Ce-Car@EV NPs對耐藥銅綠假單胞菌的抗菌效果。 h 不同濃度Car和Ce-Car@EV NPs與耐藥銅綠假單胞菌共孵育4小時后的細菌活力。 i 對應(yīng)h圖的耐藥銅綠假單胞菌平板計數(shù)數(shù)據(jù)。

為了深入揭示其克服耐藥性的機制，研究團隊進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果表明，與游離羧芐青霉素誘導(dǎo)的耐藥菌相比，經(jīng)Ce-Car@EV NPs處理的細菌其基因表達譜變化幅度更小。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析顯示，差異基因顯著富集在碳代謝、氧化磷酸化、糖酵解/TCA循環(huán)等能量代謝通路上。熱圖分析進一步揭示，Ce-Car@EV NPs能顯著下調(diào)耐藥菌中高表達的外排泵基因（如mexA、mexB、oprM），并將其表達水平恢復(fù)至正常。同時，氧化磷酸化復(fù)合物I和IV的基因（如nuoE、ccoN2）以及TCA循環(huán)和糖酵解的關(guān)鍵酶基因（如acnA、pykA）也顯著下調(diào)。功能實驗驗證了這些轉(zhuǎn)錄水平的變化：Ce-Car@EV NPs以濃度依賴的方式顯著降低細菌內(nèi)ATP含量（100 μg/mL時降低60%），并抑制呼吸鏈復(fù)合物I和IV的活性，從而阻斷了外排泵的能量供應(yīng)，使其外排功能顯著下降。這一系列多層次、多靶點的調(diào)控，構(gòu)成了其逆轉(zhuǎn)耐藥性的強大分子基礎(chǔ)。

圖4. Ce-Car@EV NPs克服銅綠假單胞菌耐藥性的機制。 a 三組細菌差異表達基因（DEGs）的韋恩圖。 b 不同處理后細菌DEGs的火山圖。 c PA-30M和PA-30R細胞間DEGs的基因本體論（GO）注釋分析。 d PA-30M和PA-30R細胞間DEGs的KEGG富集分析。 e 基于表達模式的細菌多藥外排相關(guān)基因的聚類分析。 f PA、PA-30R和PA-30M細胞中氧化磷酸化相關(guān)基因的熱圖。 g PA、PA-30R和PA-30M細胞中TCA循環(huán)和糖酵解相關(guān)基因的熱圖。 h Ce-Car@EV NPs作用于氧化磷酸化過程的機制示意圖。 i 不同濃度Ce-Car@EV NPs直接孵育后的ATP含量。 j 經(jīng)不同濃度Ce-Car@EV NPs處理24小時后，銅綠假單胞菌內(nèi)的ATP含量。 k Ce-Car NCPs對細菌呼吸鏈復(fù)合物I和IV活性的影響。 l 不同濃度Ce-Car@EV NPs對耐藥銅綠假單胞菌藥物外排泵活性的影響。

生物安全性是臨床應(yīng)用的前提。體外細胞毒性實驗顯示，即使?jié)舛雀哌_512 μg/mL，Ce-Car@EV NPs與L929、RAW 264.7等細胞共培養(yǎng)24小時后，細胞活力仍高于80%，且溶血率低于5%。在體內(nèi)，注射了Ce-Car@EV NPs的小鼠在7天內(nèi)體重、體溫、血常規(guī)、血清生化指標(biāo)及主要器官組織切片均未見明顯異常，大腦皮層中的氧化應(yīng)激標(biāo)志物也無顯著變化，證明了其優(yōu)異的生物相容性。

得益于EVs的仿生偽裝，Ce-Car@EV NPs展現(xiàn)了卓越的體內(nèi)靶向能力?；铙w成像結(jié)果顯示，在感染耐藥銅綠假單胞菌的肺炎小鼠模型中，Ce-Car@EV NPs在感染肺部的富集量遠超未包覆的Ce-Car NCPs，且熒光信號可持續(xù)長達24小時。藥代動力學(xué)研究表明，其血液循環(huán)半衰期達到了6.68小時，主要通過肝臟代謝和腎臟排泄兩條途徑在7天內(nèi)近乎完全清除，無明顯器官蓄積。

圖5. Ce-Car@EV NPs的體內(nèi)藥代動力學(xué)、生物分布與代謝。 a Ce-Car@EV NPs體內(nèi)成像流程示意圖。 b 尾靜脈注射Ce-Car NCPs或Ce-Car@EV NPs后不同時間點，耐藥銅綠假單胞菌肺炎小鼠的代表性體內(nèi)熒光圖像。 c 注射后不同時間點，感染肺區(qū)熒光信號強度的定量分析。 d 注射后6小時，主要器官和感染肺組織的熒光圖像。 e 對應(yīng)d圖的熒光強度定量分析。 f 靜脈注射后指定時間點血液中鈰濃度定量，以及通過非房室模型確定的循環(huán)半衰期。 g 注射后7天內(nèi)不同時間段糞便中排出的鈰質(zhì)量。 h 注射后7天內(nèi)不同時間段尿液中排出的鈰質(zhì)量。

在由耐藥銅綠假單胞菌引起的急性肺炎小鼠模型中，Ce-Car@EV NPs展現(xiàn)了強大的治療潛力。與生理鹽水、游離羧芐青霉素和Ce-Car NCPs處理組在36小時內(nèi)全部死亡不同，Ce-Car@EV NPs處理組的小鼠存活率顯著提高，且體重、體溫保持穩(wěn)定，臨床評分也明顯改善。治療后12小時，Ce-Car@EV NPs組小鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的細菌載量比其他組降低了2個多數(shù)量級，且有效阻止了細菌向心、肝、脾、腎等器官的擴散。治療60小時后，其肺組織中的細菌負荷進一步降低。肺組織切片的免疫熒光染色也直觀地證實了其卓越的殺菌效果。

圖6. Ce-Car@EV NPs對耐藥銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肺部感染的體內(nèi)治療效果。 a 建立耐藥銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的急性肺部感染模型和治療方案的設(shè)計。 b 經(jīng)Car、Ce-Car NCPs或Ce-Car@EV NPs治療的感染小鼠在36小時內(nèi)的存活率。 c 接受不同治療后，感染小鼠在12小時內(nèi)體溫的變化。 d 接受不同治療后，感染小鼠在12小時內(nèi)體重的變化。 e 不同處理后小鼠肺組織的數(shù)碼圖像。 f 評估六個參數(shù)的臨床評分。 g 治療后12小時，肺勻漿中存活細菌的定量。 h 治療后12小時，支氣管肺泡灌洗液（BALF）中存活細菌的定量。 i 用抗耐藥銅綠假單胞菌抗體染色的肺切片免疫熒光圖像。

通過對肺組織損傷指標(biāo)的評估，Ce-Car@EV NPs的治療優(yōu)勢進一步凸顯。該處理組小鼠的肺濕干比（反映肺水腫程度）顯著低于其他感染組，支氣管肺泡灌洗液中的總蛋白濃度和乳酸脫氫酶（LDH）活性也最低，表明其有效減輕了感染引起的肺水腫和組織損傷。H&E染色和Masson染色結(jié)果顯示，Ce-Car@EV NPs處理組小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)接近正常，炎癥細胞浸潤和纖維化程度最輕，而其他處理組的肺部則表現(xiàn)出明顯的病理損傷。

圖7. Ce-Car@EV NPs對耐藥銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肺炎感染的療效。 a 不同治療組的肺濕干比。 b 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的總蛋白濃度。 c 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的乳酸脫氫酶（LDH）活性。 d 治療后12小時小鼠的肺指數(shù)。 e 不同治療組肺切片的代表性H&E染色圖像。 f 不同治療組肺切片的代表性Masson染色圖像。

總結(jié)與展望

綜上所述，這項研究成功構(gòu)建了一種名為Ce-Car@EV的仿生pH響應(yīng)性納米平臺，通過協(xié)同整合姜來源細胞外囊泡與鈰-羧芐青霉素配位納米顆粒，為對抗和逆轉(zhuǎn)革蘭氏陰性菌的抗菌素耐藥性提供了創(chuàng)新方案。該平臺的核心優(yōu)勢在于其獨特的雙重作用機制：一方面通過靶向遞送和pH響應(yīng)釋放，實現(xiàn)抗生素在感染部位的高效富集；另一方面，釋放的Ce??離子通過耗竭細胞內(nèi)ATP、破壞氧化磷酸化和抑制外排泵活性，從能量代謝根源上“釜底抽薪”，逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性。體內(nèi)外實驗結(jié)果一致證實了其卓越的抗菌效果和良好的生物安全性。這項工作不僅超越了傳統(tǒng)依賴外源能量的系統(tǒng)，直接靶向耐藥性的生理基礎(chǔ)，而且植物源囊泡的免疫調(diào)節(jié)潛力也為未來的抗感染治療提供了更廣闊的空間，為臨床治療多重耐藥菌感染開辟了一條充滿希望的新途徑。