近日，復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/上海市重大傳染病和生物安全研究院張榮團(tuán)隊(duì)等合作在Nature Communications發(fā)表題為“Development of a replication-defective mpox virus platform for fundamental and therapeutic research”重要研究成果。該研究成功構(gòu)建了基于細(xì)菌人工染色體（BAC）的復(fù)制缺陷型猴痘病毒（replication-defective MPXV, rdMPXV）平臺(tái)。該平臺(tái)通過(guò)雙基因（OPG96/OPG158）缺失策略獲得了單輪感染的復(fù)制缺陷型病毒顆粒，完整保留了病毒的生命周期關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究者以此為工具，完成了概念驗(yàn)證性高通量藥物篩選，發(fā)現(xiàn)了新型抗痘病毒先導(dǎo)化合物G243-1720，并意外發(fā)現(xiàn)該化合物與已獲批藥物特考韋瑞（tecovirimat）雖結(jié)構(gòu)迥異，卻共享同一靶點(diǎn)（OPG57/F13），通過(guò)誘導(dǎo)靶蛋白二聚化發(fā)揮抑制作用。本研究不僅為猴痘病毒的基礎(chǔ)研究提供了安全、靈活且強(qiáng)大的遺傳學(xué)操作平臺(tái)，也為抗痘病毒藥物和疫苗研發(fā)開(kāi)辟了新路徑。

研究背景與挑戰(zhàn)：猴痘病毒研究的“高墻”

猴痘病毒(MPXV) 隸屬痘病毒科正痘病毒屬，該病毒與天花病毒、痘苗病毒及牛痘病毒等重要病原體存在密切親緣關(guān)系。2022年MPXV Clade IIb在世界范圍內(nèi)的流行以及2024年的MPXV Ib分支病例的大量增加致使世界衛(wèi)生組織兩次將其列為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件 (PHEIC)，揭示了MPXV持續(xù)演變的公共衛(wèi)生威脅。目前臨床可用的抗MPXV藥物寥寥（僅tecovirimat和cidofovir/brincidofovir），且存在療效不確定性或毒副作用等問(wèn)題。然而，猴痘病毒近200kb龐大且復(fù)雜的病毒基因組以及對(duì)其操作所需的高生物安全級(jí)別限制了科學(xué)家對(duì)其復(fù)制機(jī)制、宿主互作、疫苗開(kāi)發(fā)和抗病毒化合物篩選的研究。傳統(tǒng)的基于同源重組和篩選標(biāo)記的基因編輯方法對(duì)MPXV效率低下、流程繁瑣。因此，開(kāi)發(fā)一種能在較低生物安全條件下模擬活病毒關(guān)鍵生命周期的研究平臺(tái)，具有重要的科學(xué)與臨床意義。

技術(shù)創(chuàng)新：構(gòu)建穩(wěn)定、安全的rdMPXV平臺(tái)

1.從“頭”組裝策略
研究團(tuán)隊(duì)摒棄了從感染性病毒出發(fā)的傳統(tǒng)改造路徑，采用了從頭合成（de novo）策略。利用酵母轉(zhuǎn)化相關(guān)重組（TAR）克隆技術(shù)，將MPXV Clade IIb基因組（~197 kb）分為23個(gè)片段進(jìn)行逐步組裝，構(gòu)建了含有病毒囊膜組裝關(guān)鍵蛋白基因OPG96 (M2R) 缺失的中間質(zhì)粒pBAC-IΔ96，并進(jìn)一步組裝了猴痘病毒全基因組的BAC質(zhì)粒pBAC-MPXVΔ96。隨后在互補(bǔ)表達(dá)OPG96的細(xì)胞上，成功包裝出復(fù)制缺陷型猴痘病毒顆粒（rdMPXVΔ96）。

2.雙重基因缺失
為進(jìn)一步提升安全性，研究團(tuán)隊(duì)在pBAC-IΔ96基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地結(jié)合CRISPR-Cas9與Lambda Red重組系統(tǒng)，在E. coli中敲除了第二個(gè)病毒囊膜組裝關(guān)鍵蛋白基因OPG158 (A32.5L)，獲得雙基因同時(shí)缺失的質(zhì)粒pBAC-IΔ96,158。隨后在互補(bǔ)表達(dá)OPG96和OPG158的細(xì)胞上，成功包裝出雙缺型復(fù)制缺陷型猴痘病毒顆粒（rdMPXVΔ96,158）。

3.平臺(tái)特性驗(yàn)證：安全性與保真度

·嚴(yán)格的復(fù)制缺陷性：rdMPXVΔ96,158只能在互補(bǔ)細(xì)胞系中完成多輪復(fù)制，在野生型細(xì)胞中僅發(fā)生單輪感染，不能產(chǎn)生子代病毒顆粒。在睡鼠（dormice）模型中，該病毒不引起體重下降或肺部有效復(fù)制，證明了其體內(nèi)安全性。

·生命周期模擬能力：在互補(bǔ)細(xì)胞中電鏡可觀察到完整的胞內(nèi)成熟病毒（IMV）和胞外包膜病毒（EEV）形態(tài)；病毒表現(xiàn)出與野生型病毒相似的細(xì)胞嗜性。

·平臺(tái)穩(wěn)定性：通過(guò)連續(xù)傳代后，病毒基因組在缺失區(qū)域和報(bào)告基因區(qū)域均未出現(xiàn)突變。

·藥效評(píng)價(jià)可靠性：使用該平臺(tái)測(cè)定的中和抗體（7D11）以及特考韋瑞和西多福韋的EC50值，與文獻(xiàn)中使用野生型病毒報(bào)道的結(jié)果高度一致，驗(yàn)證了平臺(tái)用于藥效評(píng)估的可靠性。

平臺(tái)應(yīng)用：發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物G243-1720

1.先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與特征

作為概念驗(yàn)證，研究者利用rdMPXVΔ96,158平臺(tái)對(duì)包含3185個(gè)小分子的化合物庫(kù)進(jìn)行了高通量篩選。篩選鑒定出化合物G243-1720，其抗MPXV活性EC50約0.23 μM，CC50 > 100 μM，選擇指數(shù)（SI）優(yōu)異。該化合物對(duì)多種正痘病毒（VACV、CPXV、CMLV、RPXV）均表現(xiàn)出廣譜抑制活性，但對(duì)禽痘病毒、皰疹病毒及RNA病毒無(wú)效，體現(xiàn)了其作用靶點(diǎn)的保守性與特異性。在SCID小鼠的MPXV感染模型中，腹腔注射（22.5 mg/kg）或口服（45 mg/kg）G243-1720，可顯著降低肺部組織病毒載量。

2.機(jī)制深度解析：與特考韋瑞殊途同歸

通過(guò)系統(tǒng)分析病毒復(fù)制周期關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)G243-1720與特考韋瑞類似，不影響病毒入侵細(xì)胞、基因組DNA復(fù)制、晚期基因表達(dá)和IMV的形成，但能顯著抑制EEV的產(chǎn)生和病毒噬斑擴(kuò)散。 在G243-1720壓力下進(jìn)行病毒傳代，篩選出位于 OPG57 (F13L) 基因的耐藥突變（A290V、D294V、I372N）。這些位點(diǎn)正是已知的特考韋瑞和另一個(gè)F13抑制劑IMCBH的經(jīng)典耐藥位點(diǎn)。攜帶I372N突變的病毒對(duì)G243-1720和特考韋瑞均表現(xiàn)出交叉耐藥，提示二者靶向同一蛋白。

分析超速離心（AUC）和質(zhì)譜光度法（mass photometry）證實(shí)，G243-1720與tecovirimat一樣，能誘導(dǎo)可溶性O(shè)PG57蛋白形成同源二聚體。耐藥突變顯著削弱了這種誘導(dǎo)能力。盡管晶體學(xué)數(shù)據(jù)分辨率有限，但在OPG57蛋白二聚體界面觀察到了與G243-1720分子形狀匹配的電子密度，進(jìn)一步支持其結(jié)合于tecovirimat相同的口袋。

總結(jié)和展望

1.創(chuàng)建了一個(gè)創(chuàng)新性的復(fù)制缺陷性猴痘病毒研究平臺(tái)

·安全性高：雙基因缺失設(shè)計(jì)，單輪感染特性，將實(shí)驗(yàn)操作的安全性要求降低。

·功能完整：模擬病毒生命周期，適用于病毒進(jìn)入、復(fù)制等多環(huán)節(jié)研究。

·靈活高效：基于BAC和CRISPR/Lambda Red系統(tǒng)，允許對(duì)龐大基因組進(jìn)行快速、多重的遺傳操作。

·轉(zhuǎn)化性強(qiáng)：已成功用于高通量藥物篩選、中和抗體評(píng)價(jià)、宿主因子鑒定等。

2.發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型先導(dǎo)化合物G243-1720

作為第三個(gè)被報(bào)道的OPG57（F13）蛋白抑制劑，具有全新的化學(xué)骨架，與特考韋瑞“殊途同歸”的作用機(jī)制，不僅驗(yàn)證了OPG57作為抗痘病毒藥物的有效靶點(diǎn)，也為開(kāi)發(fā)具有不同藥學(xué)特性的備份藥物或聯(lián)合用藥方案奠定了基礎(chǔ)。

總之，復(fù)制缺陷型猴痘病毒平臺(tái)可用于更廣泛的宿主-病毒互作研究、疫苗評(píng)估及大規(guī)模藥物篩選，以及作為載體開(kāi)發(fā)新型疫苗等。G243-1720作為先導(dǎo)化合物則還需進(jìn)行系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，包括結(jié)構(gòu)優(yōu)化、安全性評(píng)價(jià)以及在不同動(dòng)物模型中的療效驗(yàn)證等，以期為應(yīng)對(duì)猴痘及其他正痘病毒威脅提供新的候選藥物。

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/上海市重大傳染病和生物安全研究院張榮研究員，中山大學(xué)張萍教授、法國(guó)巴斯德所Pablo Guardado-Calvo研究員、中國(guó)農(nóng)科院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所魯會(huì)軍研究員以及復(fù)旦大學(xué)謝幼華教授為本文共同通訊作者。復(fù)旦大學(xué)博士后陳建南和博士生胡力元、法國(guó)巴斯德所Riccardo Vernuccio、吉林大學(xué)史寧為共同第一作者。該研究得到了中科院藥物研究所Geoffrey L. Smith和陸泳旭研究員、 復(fù)旦大學(xué)蔡啟良教授、中國(guó)醫(yī)科院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所薛婧研究員等的指導(dǎo)和幫助。該研究也得到了上海市市級(jí)科技重大專項(xiàng)“重大突發(fā)傳染病防控關(guān)鍵核心技術(shù)研究”、上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人項(xiàng)目等的資助。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-67487-w

編輯：吃一口小貓