病毒如何利用宿主細(xì)胞機(jī)制進(jìn)行RNA復(fù)制？這一問題對理解病毒生物學(xué)、宿主范圍和抗病毒藥物開發(fā)至關(guān)重要。傳統(tǒng)全基因組CRISPR敲除篩選常受病毒入口階段主導(dǎo)，難以專攻復(fù)制依賴因子。近日，一項(xiàng)研究引入病毒復(fù)制子系統(tǒng)，成功識別三種RNA病毒的復(fù)制特異宿主因子，為病毒學(xué)提供新工具。

2025年12月10日，在《Nature Communications》期刊在線發(fā)表題為“Replicon-based genome-wide CRISPR knockout screening for the identification of host factors involved in viral replication”的文章，該研究由美國Chan Zuckerberg Biohub的研究團(tuán)隊(duì)主導(dǎo)此項(xiàng)工作，并與美國國家過敏和傳染病研究所合作。該團(tuán)隊(duì)針對登革病毒2型（DENV-2，正鏈RNA病毒，F(xiàn)laviviridae科）、基孔肯雅病毒（CHIKV，正鏈RNA病毒，Togaviridae科）和埃博拉病毒（EBOV，負(fù)鏈RNA病毒，F(xiàn)iloviridae科）進(jìn)行篩選，這些病毒代表不同復(fù)制策略和家族，具有顯著公共衛(wèi)生意義。復(fù)制子CRISPR敲除（KO）篩選在生物安全二級（BSL-2）條件下繞過病毒入口和出口，專注識別復(fù)制必需基因。該方法補(bǔ)充活病毒篩選的不足，并驗(yàn)證候選基因在活病毒感染中的作用。

傳統(tǒng)篩選的局限：入口偏倚與下游因子缺失

病毒生命周期包括入口、翻譯、復(fù)制、組裝和出口。全基因組CRISPR敲除篩選通過細(xì)胞存活選擇鑒定宿主因子，曾快速解析SARS-CoV-2機(jī)制。但結(jié)果常變異大，入口因子（如受體）主導(dǎo)，復(fù)制因子易被忽略。例如，DENV-2活病毒篩選反復(fù)識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白復(fù)合體（EMC）和寡糖轉(zhuǎn)移酶（OST），但某些RNA結(jié)合蛋白（如ASCC3、RRBP1）僅在部分篩選中出現(xiàn)。CHIKV篩選限于入口受體MXRA8和復(fù)制因子FHL1。EBOV高致死率要求BSL-4操作，限制篩選規(guī)模。

這些局限源于病毒生物學(xué)：多受體使用、復(fù)制動力學(xué)差異等。變異方法如熒光激活細(xì)胞分選（FACS）黃熱病毒篩選或嵌入gRNA的病毒基因組篩選已識別部分下游因子，但缺乏專攻復(fù)制的通用平臺。復(fù)制子——去除結(jié)構(gòu)基因的亞基因組RNA——保留非結(jié)構(gòu)基因編碼復(fù)制酶，用熒光報告子（如eGFP）替換，提供自主復(fù)制而不產(chǎn)生感染顆粒的系統(tǒng)。

方法創(chuàng)新：穩(wěn)定復(fù)制子細(xì)胞系的構(gòu)建與篩選

團(tuán)隊(duì)開發(fā)可擴(kuò)展策略生成穩(wěn)定復(fù)制子細(xì)胞系，使用Huh7.5.1-Cas9細(xì)胞，確保報告子表達(dá)均勻（>80% eGFP陽性）和對抑制敏感。以DENV-2基準(zhǔn)：基于16681株，插入eGFP-Zeocin融合盒子，添加PEST序列縮短eGFP半衰期。Western blot確認(rèn)NS2B、NS3、NS4B表達(dá)；RNA聚合酶抑制劑7-deaza-2'-C-methyladenosine（MK-0608）劑量依賴降低信號；EMC/OST敲除抑制eGFP。

篩選用Brunello gRNA文庫（全基因組覆蓋）轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，F(xiàn)ACS分選eGFP低群（復(fù)制受阻），高通量測序分析gRNA豐度，MAGeCK軟件計(jì)算基因富集。類似擴(kuò)展至CHIKV（基于LR-2006 OPY1株，優(yōu)化eGFP-Zeocin）和EBOV（整合4cis系統(tǒng)：NP、VP35、VP30、L基因，支持負(fù)鏈小基因組復(fù)制）。

DENV-2篩選結(jié)果：已知復(fù)合體與新型翻譯調(diào)控因子

DENV-2篩選富集已知復(fù)制必需復(fù)合體：EMC、OST、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）和ER轉(zhuǎn)位子?；虮倔w（GO）分析突出ER相關(guān)通路，與文獻(xiàn)一致。比對先前Huh7.5.1活病毒篩選，共享核心因子，但復(fù)制子獨(dú)家識別15基因，包括DOHH、PRKRA、SEL1L、SENP1、UBE2G2、ZFP36L2。其中，SEL1L曾在DENV-2插入突變篩選中出現(xiàn)，UBE2G2參與ERAD，在西尼羅病毒中調(diào)控蛋白穩(wěn)態(tài)。

驗(yàn)證：單個敲除在復(fù)制子細(xì)胞減少eGFP（DOHH等6個顯著）?；頓ENV-2感染（MOI=0.1，48 h）用熒光素酶報告病毒和RT-qPCR確認(rèn)，敲除降低病毒蛋白和RNA水平（如PRKRA敲除RNA降至對照60%）。

CHIKV篩選結(jié)果：壓力顆粒與高爾基體運(yùn)輸依賴

CHIKV復(fù)制子優(yōu)化后穩(wěn)定表達(dá)（>90% eGFP），敲除G3BP1（與nsP3互作）降低信號，MXRA8（入口因子）無影響。篩選富集18基因：壓力顆粒（CSDE1、G3BP1/2）、高爾基運(yùn)輸（EPS15L1、GOLGA7、SEPTIN6）、翻譯后修飾（BAG6、PCBD1、POFUT2）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控（CEBPA等）和雜類。

驗(yàn)證CSDE1（RNA結(jié)合蛋白，調(diào)控壓力顆粒）和GOLGA7（高爾基膜組件，涉運(yùn)輸）?；頒HIKV感染（LR-2006 OPY1，MOI=0.1）RT-qPCR顯示，CSDE1/GOLGA7敲除延緩RNA積累（25 h低于對照70%），G3BP2影響更強(qiáng)，與文獻(xiàn)一致。這反映CHIKV復(fù)制復(fù)合體在質(zhì)膜球狀體形成，依賴壓力顆粒動態(tài)（nsP3劫持G3BP避免防御）和高爾基-質(zhì)膜交通。

EBOV篩選結(jié)果：組蛋白修飾酶與泛素化途徑的角色

EBOV復(fù)制子整合4cis系統(tǒng)（NP、VP35、VP30、L），轉(zhuǎn)錄Zeocin-eGFP小基因組，穩(wěn)定>90% eGFP。敲除L或DYNLL1（已知復(fù)制因子）降低信號，NPC1（入口受體）無影響。篩選富集獨(dú)特基因：組蛋白修飾酶（EHMT1/2、EP300）、泛素家族（FBXO28、USP7/12）、磷酸酶/激酶（DUSP6/18、PPP1R12B/3CB、PRKC1）、免疫球蛋白超家族（CD19、ICAM4）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（NRIP1、PSIP1、ZNF182/865）。

驗(yàn)證七個一致命中和九個額外基因：EHMT1、EHMT2、USP7顯著降低eGFP。鏈特異RT-qPCR顯示敲除減少vRNA、cRNA、mRNA。瞬時轉(zhuǎn)染確認(rèn)不是4cis整合效應(yīng)，4cis蛋白表達(dá)不變。這暗示EHMT1/2（賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶）和USP7（去泛素酶）調(diào)控EBOV復(fù)制，可能通過非組蛋白甲基化或VP35/NP泛素化，與Sendai病毒包容體形成類似。

結(jié)果驗(yàn)證與比較：病毒特異性與方法可靠性

候選基因使用單個敲除、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和RT-qPCR驗(yàn)證，編輯效率高。DENV-2和CHIKV在活感染確認(rèn)，EBOV用瞬時系統(tǒng)。比較顯示特異性：DENV-2偏ER蛋白穩(wěn)態(tài)，CHIKV涉壓力和高爾基，EBOV偏表觀遺傳調(diào)控，與HEV早期內(nèi)體依賴不同。

方法魯棒：Brunello覆蓋全，MAGeCK分析可靠。RNA測序顯示DENV-2復(fù)制子穩(wěn)定（99.9%匹配）。局限包括報告子偏倚和培養(yǎng)漂移，但交叉驗(yàn)證緩解。

研究觀點(diǎn)：補(bǔ)充工具與潛在應(yīng)用

復(fù)制子CRISPR篩選補(bǔ)充活病毒方法，專注下游因子，適用于BSL-2，揭示病毒特異機(jī)制。該研究報告新因子，如DENV-2翻譯調(diào)控和EBOV甲基轉(zhuǎn)移酶作用。這些提供宿主導(dǎo)向抗病毒靶點(diǎn)，減少潛在風(fēng)險。

展望：擴(kuò)展至更多病毒，結(jié)合CRISPRi/a分析必需基因，或蛋白質(zhì)組學(xué)繪網(wǎng)絡(luò)，深化病毒-宿主互動。最終，或開發(fā)廣譜藥物靶向保守通路，如EMC/OST，應(yīng)對疫情。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-65979-3