FERONIA（FER）屬于長春花受體激酶家族CrRLK1L的核心成員之一，具有胞外區(qū)、跨膜區(qū)及細胞內(nèi)激酶區(qū)的典型結(jié)構(gòu)，這決定了其通過信號轉(zhuǎn)導調(diào)控植物發(fā)育的重要性。近二十年研究表明，F(xiàn)ER受體激酶在植物生長發(fā)育、抗逆及抗病中發(fā)揮重要作用。而FER對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及作物性狀改良方面有待進一步深入研究。因此，開發(fā)高效的FER小分子工具，對于揭示其在精準農(nóng)業(yè)中的調(diào)控機制具有重大意義。

2025年11月6日，北京大學化學與分子工程學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心雷曉光團隊與華東師范大學生命科學學院李超團隊在PNAS上在線發(fā)表題為Unveiling FERONIA Receptor Kinase-mediated Cellular Mechanisms with Small Molecule Inhibitor的研究論文。作者通過高通量篩選及根毛表型實驗，從4,378種化合物中鑒定出OTSSP167（命名Ferovicin，簡稱FRV）。通過結(jié)構(gòu)生物學發(fā)現(xiàn)FRV結(jié)合于FER激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合口袋。利用定量磷酸化蛋白質(zhì)組學和FRV小分子工具，發(fā)現(xiàn)FRV抑制RALF1-FER-AHA2級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導細胞外環(huán)境堿化，調(diào)控細胞伸長。同時，RALF1通過促使FER的Ser695位點發(fā)生磷酸化，進而激活其功能。

本研究通過解析FER激酶區(qū)與FRV小分子的共晶結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RV結(jié)合于FER激酶的ATP口袋（圖1），與Lys565、Tyr610、Tyr612、Met613、Asp679等關(guān)鍵殘基通過氫鍵和π-π堆積作用穩(wěn)定結(jié)合。FRV解離常數(shù)（0.4 μM）遠低于對照ATP (18.37 μM），表明FRV是一種高效的ATP競爭性抑制劑。ADP-Glo激酶活性檢測實驗顯示，F(xiàn)RV對FER的IC50值為70 nM，活性優(yōu)于之前發(fā)現(xiàn)的其他抑制劑。進一步獲取了關(guān)鍵結(jié)合位點的點突變體包括K565A、Y610A、Y612A、M613A和D679A的，驗證了FRV和FER的分子結(jié)合機制。體外酶活實驗表明K565A、Y610A和D679A突變顯著削弱FRV抑制效果（IC50> 100 μM），且Y612A和M613A突變也會降低激酶基礎(chǔ)活性。表面等離子共振實驗顯示Y612A突變導致FRV結(jié)合親和力降低超1000倍，凸顯該殘基在抑制劑識別中的關(guān)鍵作用。以上結(jié)果共同證實FER的ATP結(jié)合口袋中五個關(guān)鍵殘基對FRV高效抑制FER激酶功能具有重要作用。

圖1. 共晶結(jié)構(gòu)揭示FRV占據(jù)FER激酶ATP結(jié)合口袋

通過激酶活性（圖2A）和表面等離子體實驗（圖2B-F）評估FRV的選擇性，結(jié)果顯示其對FER激酶具有高度特異性，結(jié)合親和力顯著高于TMK4、BRI1等其它重要植物激酶，選擇性差異達數(shù)十倍。結(jié)構(gòu)分析與分子對接表明，F(xiàn)RV與FER結(jié)合口袋中關(guān)鍵殘基（K565、Y610等）形成的疏水作用及氫鍵網(wǎng)絡(luò)是其選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，且結(jié)合構(gòu)象更為穩(wěn)定。此外，關(guān)鍵殘基在苔蘚和多種代表性被子植物中高度保守，揭示FRV具備廣譜抑制多物種中FER激酶的潛力。

圖2. 酶活與結(jié)合親和力分析揭示FRV對FER激酶的抑制機制

通過磷酸化蛋白質(zhì)組學方法，發(fā)現(xiàn)RALF1小肽誘導了FER關(guān)鍵位點S695的磷酸化，而FRV處理抑制該位點的磷酸化（圖3A）。進一步通過組間的差異比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RV通過阻斷FER–RALF1的磷酸化，干擾了其下游信號通路。RALF1/CK和RALF1/(FRV+RALF1)之間有345個共同上調(diào)和364個共同下調(diào)的磷酸化蛋白（圖3B）。對這些共同蛋白進行GO分析，結(jié)果顯示主要富集于細胞生長、分裂、極性建成、細胞骨架組織等生物學過程（圖3C）。

圖3. 磷酸化組學發(fā)現(xiàn)FRV影響RALF1–FER信號通路

組學分析中發(fā)現(xiàn)在RALF1–FER介導的磷酸化蛋白中，質(zhì)子泵AHA1/2的 S899位點磷酸化水平顯著上調(diào)（圖4B）。通過進一步檢測主根表皮分生區(qū)細胞的伸長情況，發(fā)現(xiàn)FRV能夠抑制RALF1–FER調(diào)控的細胞伸長過程（圖4A）。通過檢測細胞長度和胞外pH水平，發(fā)現(xiàn)AHA2S899D轉(zhuǎn)基因株系對RALF1呈現(xiàn)不敏感，而FRV可有效抑制RALF1效果（圖4C, D）。通過構(gòu)建多種組合的單點突和多點突變體轉(zhuǎn)基因材料，發(fā)現(xiàn)FRV抑制FER的活性主要是通過影響其中兩個關(guān)鍵位點Y610和K565，而Y612、M613和D679的影響相對較?。▓D4E）。

圖4. RALF1–FER通過AHA1/2S899介導的胞外堿化作用調(diào)控細胞伸長

磷酸化蛋白組學還揭示了FRV抑制RALF1誘導的FER S695位點的磷酸化，而利用廣譜磷酸化抗體檢測，結(jié)果顯示FRV處理有效抑制了RALF1誘導的FER磷酸化（圖5A）。同時，采用制備的FER S695/T696磷酸化特異性抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)RALF1處理顯著促進野生型中FER的磷酸化水平升高（圖5B）。通過檢測細胞長度和胞外pH水平，發(fā)現(xiàn)FERS695A突變體對RALF1處理不敏感（圖5C, D）。以上結(jié)果表明通過FRV的處理和分析，有效地找出了S695是FER感受RALF1小肽而激活的關(guān)鍵位點，其對于調(diào)控細胞伸長具有重要作用。

圖5. RALF1通過激活FER-S695A磷酸化調(diào)控細胞伸長

綜上所述，本研究篩選出高效選擇性的FER激酶小分子抑制劑FRV，通過共晶結(jié)構(gòu)解析等發(fā)現(xiàn)其特異性結(jié)合于FER激酶區(qū)的ATP口袋，從而抑制FER激酶活性。利用小分子工具FRV并結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)RALF1信號處理引起的關(guān)鍵磷酸化位點S695位點激活FER、引發(fā)下游AHA1/2質(zhì)子泵S899位點的磷酸化，從而調(diào)控主根表皮分生區(qū)細胞生長。本研究闡明了FRV小分子化合物是FER有效的激酶抑制劑，該抑制劑對于解析FER受體激酶參與的生物學過程的研究和信號機制的解析具有重要輔助作用，并有望成為農(nóng)作物遠緣雜交育種和免疫調(diào)控的重要工具。

華東師范大學生命科學學院李超教授和北京大學雷曉光教授為共同通訊作者，北京大學博士后孫萌澤和華東師范大學博士后逯佰艷為共同第一作者，上海師范大學戴紹軍教授和任巍巍博士參與了該項研究。該工作得到了國家自然科學基金杰出青年基金和重點項目、國家重點研發(fā)計劃、上海市科學技術(shù)委員會項目、The National Science Foundation of the US、北京分子科學國家研究中心、北大-清華生命科學聯(lián)合中心和博士后面上項目等的支持。

論文鏈接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2515322122