DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是最重要的表觀遺傳修飾之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用；而DNA去甲基化對(duì)于維持全基因組適當(dāng)?shù)腄NA甲基化水平至關(guān)重要。ROS1作為首個(gè)被報(bào)導(dǎo)的DNA去甲基化酶，其去甲基化機(jī)制與生物學(xué)功能一直是該領(lǐng)域的核心科學(xué)問(wèn)題。然而，目前仍存在以下關(guān)鍵未解難題：1）由于ROS1蛋白DNA結(jié)合能力較弱，其全基因組結(jié)合圖譜與特征至今未知，極大限制了對(duì)其功能的全面理解；2）傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為ROS1去甲基化的主導(dǎo)模式為主動(dòng)模式，但該范式存在悖論——廣泛且頻繁的堿基切除修復(fù)嚴(yán)重威脅基因組穩(wěn)定性；3）ROS1是否具有DNA去甲基化之外的功能仍有待闡明。

近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜團(tuán)隊(duì)趙倫教授聯(lián)合南方科技大學(xué)朱健康院士在Nature Plants發(fā)表題為“Occupancy-basedmechanismis thechiefmode of ROS1function inpreventing DNAhypermethylation”的研究論文。該研究以甘藍(lán)型油菜和擬南芥為對(duì)象，澄清了ROS1去甲基化機(jī)制的關(guān)鍵爭(zhēng)議，并解決了其與基因組穩(wěn)定性的長(zhǎng)期悖論；首次繪制了ROS1高質(zhì)量全基因組結(jié)合圖譜，揭示ROS1作為染色質(zhì)可及性關(guān)鍵標(biāo)志與調(diào)控者的新功能；并進(jìn)一步闡明了上述兩種功能之間的相關(guān)性與獨(dú)立性，從而重塑DNA去甲基化酶的功能認(rèn)知框架。

ROS1調(diào)控?cái)M南芥與油菜氣孔發(fā)育

ROS1在油菜氣孔發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控功能。在甘藍(lán)型油菜中，ROS1有兩個(gè)同源拷貝，功能冗余。利用CRISPR/Cas9構(gòu)建的bnaros1突變體表現(xiàn)為氣孔數(shù)目顯著增多且氣孔附近小細(xì)胞簇增多等表型。與之相比，擬南芥ros1-4突變體主要表現(xiàn)為小細(xì)胞簇增多(Yamamuro et al., Nature Communications. 2014)，表明ROS1在油菜中可能存在功能分化。

圖1. 甘藍(lán)型油菜bnaros1單突變體和雙突變體的氣孔發(fā)育表型

首次繪制ROS1高質(zhì)量全基因組結(jié)合圖譜，揭示其為可及性染色質(zhì)標(biāo)記

精準(zhǔn)鑒定ROS1全基因組結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于全面理解其功能至關(guān)重要。盡管ChIP-seq被認(rèn)為是鑒定全基因組組蛋白修飾和染色質(zhì)相關(guān)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的金標(biāo)準(zhǔn)，ROS1因DNA結(jié)合能力弱，其全基因組結(jié)合位點(diǎn)與特征至今未知。為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，該團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)發(fā)了高效、靈敏、普適于植物經(jīng)濟(jì)器官與低豐度染色質(zhì)相關(guān)蛋白的新技術(shù)aChIP（Zhang, et al., Nature Plants. 2024; 中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利：CN117431294B）。鑒于在該領(lǐng)域取得的進(jìn)展，近期受邀在《中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)》撰寫(xiě)綜述《植物ChIP-seq技術(shù)的革新與應(yīng)用》，系統(tǒng)總結(jié)技術(shù)進(jìn)展，提出數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并展望其在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析與作物遺傳改良中的應(yīng)用前景。

本研究利用aChIP技術(shù)在擬南芥和油菜中首次繪制了高質(zhì)量的ROS1全基因組結(jié)合圖譜。整合表觀基因組分析表明，ROS1結(jié)合位點(diǎn)并非隨機(jī)分布，而與可及性染色質(zhì)高度共定位；且在不同組織及基因型（如hda6）中，這一共定位模式保持穩(wěn)定。據(jù)此，研究人員首次提出ROS1可作為可及性染色質(zhì)的重要標(biāo)記。支持這一觀點(diǎn)的是，ROS1在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出非特異性DNA結(jié)合特性，這與其廣泛分布于可及性染色質(zhì)區(qū)域以及缺乏典型序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)一致。因此，ROS1可能并非像轉(zhuǎn)錄因子那樣通過(guò)特異性序列識(shí)別招募至基因組，這一發(fā)現(xiàn)拓展了ROS1與染色質(zhì)相互作用的認(rèn)知框架。

圖2. ROS1全基因結(jié)合位點(diǎn)（占位）與可及性染色質(zhì)共定位。

N與C端結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)ROS1家族蛋白差異性靶向可及性染色質(zhì)

通過(guò)一系列結(jié)構(gòu)域截短實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ROS1對(duì)可及性染色質(zhì)的特異性結(jié)合不依賴(lài)CXXC結(jié)構(gòu)域，而主要由N端（富含賴(lài)氨酸）與C端（含RRM）結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，缺失任一結(jié)構(gòu)域均會(huì)改變其結(jié)合模式。由于油菜兩個(gè)ROS1同源蛋白的N端高度保守，其結(jié)合模式保持一致；相比之下，ROS1家族的其他成員（DME、DML2、DML3）由于N端結(jié)構(gòu)存在較大差異，其結(jié)合模式類(lèi)似截短的ROS1，并偏向H3K4me3等特定活躍位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，N端與C端結(jié)構(gòu)域的差異是ROS1家族蛋白靶向分化的核心機(jī)制。

圖3. N端與C端結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗OS1特異性靶向可及性染色質(zhì)至關(guān)重要

ROS1僅直接調(diào)控約四分之一的DNA甲基化差異位點(diǎn)

先前普遍認(rèn)為ROS1直接調(diào)控所有DNA甲基化差異位點(diǎn)（ros1-4 vs Col-0 hyper-DMR）。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)ROS1結(jié)合位點(diǎn)（Type I，約94%）在ros1-4突變體中仍保持低甲基化狀態(tài)，表明這些位點(diǎn)不受ROS1調(diào)控；ROS1僅直接結(jié)合并調(diào)控約25%的甲基化差異位點(diǎn)（Type II），其余約75%位點(diǎn)（Type III）缺乏明顯ROS1結(jié)合信號(hào)，應(yīng)為間接調(diào)控。這些結(jié)果重塑了對(duì)ROS1調(diào)控功能及作用方式的認(rèn)知：它僅直接調(diào)控少部分DNA甲基化差異位點(diǎn)，但可能在調(diào)控染色質(zhì)可及性中發(fā)揮廣泛作用。

圖4. ROS1僅直接調(diào)控約四分之一的DNA甲基化差異位點(diǎn)

ROS1占位機(jī)制阻止RdDM招募，維持DNA低/無(wú)甲基化狀態(tài)

先前研究表明，ROS1拮抗RdDM（RNA-directed DNA methylation）維持基因組低/無(wú)甲基化狀態(tài)，但其分子機(jī)制尚不清楚。為此，本研究提出兩種假設(shè)：1）ROS1與RdDM同時(shí)靶向相同位點(diǎn)，一邊建立DNA甲基化一邊去除甲基化；2）ROS1通過(guò)占位阻止RdDM招募從而抑制DNA甲基化建立，使得RdDM僅在ROS1缺失時(shí)發(fā)揮作用。

本研究通過(guò)整合ROS1與NRPD1的全基因組結(jié)合圖譜及相關(guān)突變體的DNA甲基化數(shù)據(jù)，將RdDM相關(guān)位點(diǎn)劃分為兩類(lèi)：I型位點(diǎn)為非ROS1靶位點(diǎn)，RdDM正常建立DNA甲基化；II型位點(diǎn)為拮抗位點(diǎn)，在野生型中幾乎沒(méi)有RdDM招募和DNA甲基化沉積，而在ROS1缺失后則被RdDM占據(jù)并建立甲基化。本研究結(jié)果支持“占位拮抗”模型（假設(shè)2），即ROS1通過(guò)占據(jù)靶位點(diǎn)阻止RdDM招募，從而維持基因組低/無(wú)甲基化狀態(tài)。該機(jī)制不僅揭示了ROS1拮抗RdDM維持DNA低/無(wú)甲基化狀態(tài)的分子基礎(chǔ)，也避免了全基因組頻繁堿基切除對(duì)基因組穩(wěn)定性造成的巨大風(fēng)險(xiǎn)。

圖5. ROS1通過(guò)占位機(jī)制拮抗RdDM，維持DNA低/無(wú)甲基化狀態(tài)

ROS1去甲基化主導(dǎo)模式為“被動(dòng)”，而非“主動(dòng)”

DNA去甲基化對(duì)維持基因組正常甲基化水平至關(guān)重要，主要包括被動(dòng)去甲基化和主動(dòng)去甲基化兩種方式。被動(dòng)去甲基化是指細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中，甲基轉(zhuǎn)移酶不再維持甲基化，導(dǎo)致甲基化逐代“稀釋”；主動(dòng)去甲基化則依賴(lài)DNA去甲基化酶直接切除甲基化堿基5mC并修復(fù)DNA。過(guò)去二十多年，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為ROS1主要通過(guò)糖苷酶/裂解酶活性直接去除5-甲基胞嘧啶（5mC），啟動(dòng)堿基切除修完成主動(dòng)去甲基化。然而，這一經(jīng)典模型存在諸多爭(zhēng)議：其一，ROS1切除甲基化堿基的證據(jù)主要來(lái)自體外實(shí)驗(yàn)，難以完全反映植物體內(nèi)真實(shí)情況；其二，ROS1缺失后基因組出現(xiàn)廣泛高甲基化，表明其確實(shí)參與去甲基化，但具體機(jī)制尚不明確；其三，該模型無(wú)法解釋一個(gè)矛盾——若全基因組范圍內(nèi)頻繁發(fā)生大規(guī)模堿基切除，基因組穩(wěn)定性如何維持？

本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ROS1去甲基化的主導(dǎo)模式為被動(dòng)去甲基化。將971位天冬氨酸替換為丙氨酸，獲得糖苷酶/裂解酶缺陷型ROS1變體ROS1D971A，該突變體完全喪失5mC酶切活性。然而，ROS1D971A的全基因組占位模式與野生型一致，依然特異性靶向可及性染色質(zhì)區(qū)域，表明其結(jié)合模式獨(dú)立于酶切活性。將ROS1D971A導(dǎo)入ros1-4突變體后，至少65%的位點(diǎn)DNA甲基化顯著降低。與此一致，ROS1D971A knock-in原位定點(diǎn)氨基酸替換材料中超過(guò)90%的位點(diǎn)顯示同樣的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，ROS1主要依賴(lài)占位機(jī)制而非酶切活性實(shí)現(xiàn)廣泛被動(dòng)去甲基化，顛覆了長(zhǎng)期以來(lái)“主動(dòng)去甲基化主導(dǎo)”的傳統(tǒng)認(rèn)知，并同時(shí)避免了全基因組頻繁切除堿基帶來(lái)的基因組穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)。

圖6. ROS1去甲基化模式主要依賴(lài)占位機(jī)制的被動(dòng)模式。

ROS1通過(guò)“現(xiàn)役—預(yù)備役”雙重策略保護(hù)可及性染色質(zhì)

鑒于ROS1廣泛占據(jù)開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域，本研究解析了其調(diào)控染色質(zhì)可及性的新功能，并提出其通過(guò)“現(xiàn)役—預(yù)備役”雙重策略發(fā)揮作用。當(dāng)某位點(diǎn)是DNA甲基化系統(tǒng)靶位點(diǎn)且該甲基化系統(tǒng)活躍時(shí)，ROS1采取“現(xiàn)役”策略：既可獨(dú)立維持少量可及性位點(diǎn)，也可與其他表觀調(diào)控因子（如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5等）合作維持染色質(zhì)可及性。相反，當(dāng)該類(lèi)位點(diǎn)暫時(shí)缺乏DNA甲基化系統(tǒng)作用時(shí)，ROS1采用“預(yù)備役”策略：一旦DNA甲基化系統(tǒng)重新建立或引入，ROS1則迅速轉(zhuǎn)為“現(xiàn)役”狀態(tài)發(fā)揮保護(hù)作用。由此，ROS1通過(guò)“現(xiàn)役—預(yù)備役”雙重策略，實(shí)現(xiàn)對(duì)所有可及性染色質(zhì)區(qū)域的動(dòng)態(tài)保護(hù)。

圖7. ROS1“現(xiàn)役”策略：獨(dú)自或與GCN5等表觀遺傳調(diào)控因子合作保護(hù)可及性染色質(zhì)。

圖8. ROS1“預(yù)備役”策略保護(hù)可及性染色質(zhì)

ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性可依賴(lài)亦可獨(dú)立于DNA甲基化

以往研究表明，DNA甲基化與染色質(zhì)可及性通常存在拮抗關(guān)系。本研究表明ROS1同時(shí)具備DNA去甲基化和染色質(zhì)可及性調(diào)控功能，但二者關(guān)系尚不明確。本研究通過(guò)分析ros1-4突變體及不同組織的DNA甲基化與染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：在部分位點(diǎn)，ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性依賴(lài)DNA甲基化的拮抗作用；而在另一部分位點(diǎn)，尤其是在不同組織間，ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性時(shí)不依賴(lài)DNA甲基化。由此可見(jiàn)，ROS1的兩種功能既相互關(guān)聯(lián)又相對(duì)獨(dú)立，拓展了對(duì)DNA甲基化與染色質(zhì)可及性關(guān)系的認(rèn)知框架。

圖9. ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性可依賴(lài)亦可獨(dú)立于DNA甲基化

綜上所述，本研究為植物表觀遺傳研究提供了重要數(shù)據(jù)資源，系統(tǒng)重塑了ROS1去甲基化模式認(rèn)知框架，揭示了ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性的新功能與雙重調(diào)控策略，并進(jìn)一步解析了這兩種功能之間復(fù)雜關(guān)系，從機(jī)制層面深化了對(duì)表觀遺傳調(diào)控體系的理解，為相關(guān)機(jī)制研究與功能解析提供了新思路與新策略。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鄧?yán)苯淌诤筒┦垦芯可旃鈼鳌㈢娢默摗①Z志博為論文共同第一作者，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙倫教授和南方科技大學(xué)朱健康院士為通訊作者。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟院士、沈金雄教授、李國(guó)亮教授、周強(qiáng)偉副研究員、章清博士、司志鑫、張敏燕，深圳大學(xué)杜璇教授、中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心毛妍斐研究員、揚(yáng)州大學(xué)吳健副教授、南方科技大學(xué)梁亞峰博士等給予了重要支持。該研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)博士后科學(xué)基金等資助。

通訊作者簡(jiǎn)介：趙倫，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，作物遺傳改良全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家油菜工程技術(shù)研究中心、湖北洪山實(shí)驗(yàn)室固定研究人員，獲國(guó)家優(yōu)秀青年科學(xué)基金、“武漢英才”優(yōu)秀青年人才等資助，任中國(guó)作物學(xué)會(huì)油料作物專(zhuān)業(yè)委員會(huì)委員。主要從事植物表觀/三維基因組學(xué)與油菜重要農(nóng)藝性狀研究，以模式植物擬南芥和多倍體模式作物油菜等為對(duì)象，綜合運(yùn)用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、表觀/三維基因組學(xué)與生物信息學(xué)等手段，解析兩者在多倍體優(yōu)勢(shì)及產(chǎn)量性狀形成中的遺傳與表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。研究成果以第一或通訊作者（含共同）發(fā)表在Nature Plants (2篇)、Genome Biology (2篇)、Nature Communications (2篇)、Autophagy和Molecular Plant (2篇)等國(guó)際主流期刊，為解析油菜等作物重要農(nóng)藝性狀調(diào)控機(jī)制及遺傳改良提供了新技術(shù)、新視角和新思路。具體研究方向如下：1）植物表觀/三維基因組學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)；2）植物表觀遺傳調(diào)控機(jī)制；3）油菜產(chǎn)量性狀調(diào)控機(jī)制；4）油菜多倍體雜種優(yōu)勢(shì)形成機(jī)制。詳情請(qǐng)查看：

https://faculty.hzau.edu.cn/zhaolun/zh_CN/index.htm

Nature Plants論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41477-026-02258-z

《中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)》論文鏈接：

https://www.sciengine.com/SSV/doi/10.1360/SSV-2025-0259