撰文|林無(wú)隅

CRISPR-Cas 基因組編輯技術(shù)雖然徹底改變了遺傳疾病的治療前景【1】，但第一代技術(shù)依賴于 DNA 雙鏈斷裂（ DSBs ），這可能導(dǎo)致基因毒性和不精確的修復(fù)結(jié)果【2】。盡管堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器避免了 DSBs ，但它們?cè)谝氪笃?DNA 以治療囊性纖維化等涉及多種突變的遺傳疾病方面仍面臨巨大挑戰(zhàn)【3-4】。現(xiàn)有的如 PASSIGE 和 CRISPR 相關(guān)轉(zhuǎn)座子等大片段插入技術(shù)【5】，往往受限于低效率、脫靶插入或產(chǎn)生基因組疤痕等問(wèn)題 。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠高效、精確地進(jìn)行基因大小的 DNA 片段定點(diǎn)插入，且不依賴宿主同源重組修復(fù)途徑的新型編輯工具，成為該領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題 。

近日 ， 瑞士蘇黎世大學(xué)生物化學(xué)系Martin Jinnek實(shí)驗(yàn)室在 Science 雜志發(fā)表了題為

Programmable genome editing in human cells using RNAguided bridge recombinases

為了尋找在人類(lèi)細(xì)胞中更有效的橋接重組酶，研究人員對(duì) 10 種 IS110 家族的候選系統(tǒng)進(jìn)行了篩選，最終發(fā)現(xiàn)源自 Citrobacter rodentium 的 ISCro4 表現(xiàn)出最高的重組活性 。通過(guò)對(duì)橋接 RNA 設(shè)計(jì)的優(yōu)化，他們發(fā)現(xiàn)將原本連接在一起的 TBL 和 DBL 拆分為兩個(gè)獨(dú)立的 RNA 分子（即 split-bridge RNA ），可以大幅提升編輯效率，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的重組陽(yáng)性率從約 36% 躍升至 68% 以上 。此外，實(shí)驗(yàn)還證明了這種拆分 RNA 設(shè)計(jì)具有穩(wěn)健的可編程性，能夠引導(dǎo) ISCro4 在新的靶點(diǎn)和供體序列之間進(jìn)行特異性重組 。

為了深入理解 ISCro4 高活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究團(tuán)隊(duì)解析了分辨率為 2.8 ? 的 ISCro4 突觸復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu) 。結(jié)構(gòu)對(duì)比分析顯示，與同家族的 IS621 相比， ISCro4 在與核酸結(jié)合的界面上存在關(guān)鍵的氨基酸差異，例如 Ser13 和 Ser63 位點(diǎn)，這些殘基與向?qū)?RNA 及 DNA 底物形成了額外的氫鍵相互作用 。此外，疏水核心和溶劑暴露表面的氨基酸替換也可能改善了酶在細(xì)胞內(nèi)的溶解度和穩(wěn)定性，這些結(jié)構(gòu)特征共同賦予了 ISCro4 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更優(yōu)越的性能 。

在應(yīng)用層面，作者驗(yàn)證了 ISCro4 在多個(gè)臨床相關(guān)基因位點(diǎn)上的編輯能力，包括切除 CNBP 基因中的致病性重復(fù)序列和翻轉(zhuǎn) CFTR 基因的第 23 號(hào)外顯子，效率分別達(dá)到約 1% 和 4% 。更為重要的是，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了在 AAVS1 安全港位點(diǎn)定點(diǎn)插入 3.5 kb 的供體 DNA ，效率超過(guò) 6% ，且測(cè)序結(jié)果未顯示由于雙鏈斷裂修復(fù)引起的插入缺失（ indels ） 。針對(duì)特異性的評(píng)估表明，雖然 ISCro4 存在一定的脫靶結(jié)合，但其重組活性主要局限于與向?qū)?RNA 錯(cuò)配少于 2 個(gè)核苷酸的位點(diǎn)，且可以通過(guò)選擇獨(dú)特的基因組靶點(diǎn)和正交供體序列來(lái)進(jìn)一步降低脫靶風(fēng)險(xiǎn) 。

綜上所述，本研究證明了ISCro4與其優(yōu)化的拆分橋接RNA系統(tǒng)相結(jié)合，能夠作為一種高效、多功能的工具，在人類(lèi)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)包括大片段插入在內(nèi)的復(fù)雜基因組重排。通過(guò)詳細(xì)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析和脫靶檢測(cè)，該研究不僅闡明了 ISCro4 高效活性的分子機(jī)制，還提出了通過(guò)篩選獨(dú)特靶點(diǎn)來(lái)規(guī)避脫靶效應(yīng)的可行策略 。鑒于人類(lèi)蛋白編碼基因中絕大多數(shù)（ 94% ）都包含可被該系統(tǒng)識(shí)別的獨(dú)特位點(diǎn)， ISCro4 為治療那些現(xiàn)有技術(shù)難以攻克的、需要大片段基因矯正的遺傳疾病提供了極具潛力的轉(zhuǎn)化途徑 。

http://doi.org/10.1126/science.adz1884 (2026).

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. M. Pacesa, O. Pelea, M. Jinek, Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies.Cell187, 1076–1100 (2024).

2. M. Kosicki, K. Tomberg, A. Bradley, Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.Nat. Biotechnol.36, 765–771 (2018).

3. E. Haapaniemi, S. Botla, J. Persson, B. Schmierer, J. Taipale, CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response.Nat. Med.24, 927–930 (2018).

4. A. V. Anzalone, P. B. Randolph, J. R. Davis, A. A. Sousa, L. W. Koblan, J. M. Levy, P.J. Chen, C. Wilson, G. A. Newby, A. Raguram, D. R. Liu, Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.Nature576, 149–157 (2019).

5. C. J. Tou, B. Orr, B. P. Kleinstiver, Precise cut-and-paste DNA insertion using engineered type V-K CRISPR-associated transposases.Nat. Biotechnol.41, 968979 (2023).

學(xué)術(shù)合作組織

（*排名不分先后）

戰(zhàn)略合作伙伴

（*排名不分先后）

轉(zhuǎn)載須知

【原創(chuàng)文章】BioArt原創(chuàng)文章，歡迎個(gè)人轉(zhuǎn)發(fā)分享，未經(jīng)允許禁止轉(zhuǎn)載，所刊登的所有作品的著作權(quán)均為BioArt所擁有。BioArt保留所有法定權(quán)利，違者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

近期直播推薦

點(diǎn)擊主頁(yè)推薦活動(dòng)

關(guān)注更多最新活動(dòng)！