神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的 “種子細(xì)胞”，具備自我更新與多向分化潛能（可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞），在神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ。?、神經(jīng)損傷及神經(jīng)精神疾?。ㄈ缫钟舭Y）的細(xì)胞治療中具有不可替代的價(jià)值。人多能干細(xì)胞（hPSC，包括胚胎干細(xì)胞 ESC 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 iPSC）可分化為 NSCs，為臨床應(yīng)用提供了無限的細(xì)胞來源。然而，當(dāng)前 hPSC 向 NSCs 誘導(dǎo)的臨床轉(zhuǎn)化仍面臨三大核心瓶頸：① 傳統(tǒng)方案依賴病毒載體、復(fù)雜轉(zhuǎn)錄因子或 undefined 培養(yǎng)基，存在成瘤風(fēng)險(xiǎn)、操作繁瑣且重復(fù)性差；② 誘導(dǎo)的 NSCs 神經(jīng)譜系定向分化潛能不足，均一性低，難以滿足臨床治療的功能需求；③ 分化機(jī)制尚未完全闡明，尤其是表觀遺傳調(diào)控與代謝重編程在神經(jīng)命運(yùn)決定中的協(xié)同作用仍不明確，制約了誘導(dǎo)體系的優(yōu)化。

為解決這些問題，研究人員嘗試通過小分子化合物調(diào)控細(xì)胞信號通路以優(yōu)化誘導(dǎo)效率。視黃酸（RA）信號與 Wnt 信號在胚胎神經(jīng)發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色，前者通過激活視黃酸受體（RAR）促進(jìn)神經(jīng)分化，后者則調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖與命運(yùn)決定。TTNPB 作為強(qiáng)效 RAR 激動(dòng)劑，已被證實(shí)參與細(xì)胞重編程與分化調(diào)控，而 CHIR99021 作為經(jīng)典 Wnt 信號激活劑，可誘導(dǎo) hPSC 向 NSCs 分化。但二者協(xié)同誘導(dǎo) hPSC 向 NSCs 分化的效果、核心機(jī)制，以及誘導(dǎo)細(xì)胞的體內(nèi)功能驗(yàn)證，此前尚未有系統(tǒng)報(bào)道。

近日，內(nèi)蒙古大學(xué)陳楊林、包斯琴、吳智敏、李喜和團(tuán)隊(duì)在國際期刊Advanced Science在線發(fā)表了一項(xiàng)突破性研究，題為TTNPB Promotes Human Pluripotent Stem Cell-to-Neural Stem Cell Transition via Modulation of Chromatin Accessibility and the S-(5'-adenosyl)-L-homocysteine/Choline Metabolic Network。該研究建立 “TTNPB+CHIR99021” 雙小分子協(xié)同誘導(dǎo)體系，在化學(xué)成分明確的 N2B27 培養(yǎng)基中，從hPSC高效分化出進(jìn)階神經(jīng)干細(xì)胞（ANSCs），并通過轉(zhuǎn)錄組、ATAC-seq、代謝組學(xué)及體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)揭示了 “表觀遺傳重塑 - 代謝重編程” 協(xié)同驅(qū)動(dòng)神經(jīng)分化的核心機(jī)制，且證實(shí) ANSCs 在抑郁模型大鼠中具有顯著治療效果，為神經(jīng)疾病細(xì)胞治療提供了全新策略。

研究團(tuán)隊(duì)首先優(yōu)化誘導(dǎo)體系：在 N2B27 化學(xué)成分明確培養(yǎng)基中，以 3μM CHIR99021（已驗(yàn)證有效濃度）聯(lián)合不同濃度 TTNPB 處理 hPSC，發(fā)現(xiàn) 0.5μM TTNPB 即可顯著上調(diào)神經(jīng)外胚層基因（SOX2、PAX6、SOX1）表達(dá)，由此確定 “0.5μM TTNPB+3μM CHIR99021+N2B27” 為最優(yōu)誘導(dǎo)體系，誘導(dǎo)的細(xì)胞命名為 ANSCs。進(jìn)一步驗(yàn)證顯示，ANSCs 具有長期自我更新能力，傳代超過 50 代仍保持穩(wěn)定核型與堿性磷酸酶（AP）陽性，顯著優(yōu)于傳統(tǒng) NSCs；免疫熒光與 RNA-seq 證實(shí)，ANSCs 低表達(dá)多能基因（OCT4、NANOG），高表達(dá)神經(jīng)外胚層關(guān)鍵基因（PAX6、SOX1、NES、NEUROG2），自發(fā)分化 9 天后，神經(jīng)元標(biāo)志物 TUBB3、膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 SOX10 表達(dá)量顯著高于傳統(tǒng) NSCs，且該體系在 H9 ESC、Z1 iPSC 等不同細(xì)胞系中均能穩(wěn)定誘導(dǎo) ANSCs，證實(shí)了體系的普適性。值得注意的是，單獨(dú)使用 TTNPB 雖能產(chǎn)生一定作用，但無法維持細(xì)胞存活與增殖，而 CHIR99021 的存在是 ANSCs 存活的必要條件 —— 去除 CHIR99021 后，僅 TTNPB 處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，證實(shí)二者的協(xié)同作用不僅體現(xiàn)在誘導(dǎo)效率，更體現(xiàn)在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持上。

為探究協(xié)同誘導(dǎo)的表觀遺傳機(jī)制，團(tuán)隊(duì)對 hPSC、傳統(tǒng) NSCs 和 ANSCs 進(jìn)行 ATAC-seq 分析，結(jié)果顯示 ANSCs 的全局染色質(zhì)可及性顯著高于 hPSC 和傳統(tǒng) NSCs，尤其是在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）±3kb 區(qū)域，表現(xiàn)出更強(qiáng)的信號富集。具體而言，神經(jīng)外胚層特異性基因（PAX6、SOX1、NEUROG2）的染色質(zhì)可及性顯著增強(qiáng)，而多能性基因（POU5F1、ZFP42）的可及性顯著降低，為神經(jīng)分化基因的轉(zhuǎn)錄激活提供了表觀遺傳基礎(chǔ)；轉(zhuǎn)錄因子活性分析顯示，ANSCs 中 PAX3/7、HOXB9 等神經(jīng)譜系轉(zhuǎn)錄因子活性升高，AP-1 復(fù)合體（JUNB、FOSL1）被激活，而 KLF 家族等多能性轉(zhuǎn)錄因子活性受抑制，形成特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；與傳統(tǒng) NSCs 相比，ANSCs 有 3758 個(gè)染色質(zhì)可及性峰上調(diào)，僅 363 個(gè)下調(diào)，且差異峰主要位于基因間區(qū)，提示 TTNPB 可能通過調(diào)控遠(yuǎn)端調(diào)控元件增強(qiáng) CHIR99021 的神經(jīng)誘導(dǎo)效應(yīng)。

非靶向代謝組學(xué)分析揭示了 ANSCs 的特異性代謝特征：與 hPSC 和傳統(tǒng) NSCs 相比，ANSCs 中 S - 腺苷同型半胱氨酸（SAH）、二磷酸腺苷（ADP）、谷胱甘肽（GSH）、L - 脯氨酸水平顯著升高，且這些代謝物與神經(jīng)外胚層基因表達(dá)呈強(qiáng)正相關(guān)。進(jìn)一步功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，外源性補(bǔ)充 SAH 可顯著上調(diào) NSCs 和 hPSC 中神經(jīng)標(biāo)志物 NESTIN 的表達(dá)（NSCs 中提升 15 倍以上），并誘導(dǎo) hPSC 形成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)；膽堿作為磷脂酰膽堿（PC）的代謝產(chǎn)物，補(bǔ)充后可劑量依賴性促進(jìn)神經(jīng)分化，50μM 時(shí)效果最佳，且與神經(jīng)基因（NEUROG1、PAX6）表達(dá)正相關(guān)；機(jī)制上，TTNPB 通過激活 RA 信號，直接上調(diào)磷脂酰乙醇胺 N - 甲基轉(zhuǎn)移酶（PEMT）的表達(dá)（其啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)可及性增強(qiáng)），促進(jìn)磷脂酰乙醇胺（PE）向 PC 轉(zhuǎn)化，進(jìn)而生成膽堿；同時(shí)，SAH 水解產(chǎn)生的同型半胱氨酸可促進(jìn) GSH 合成，形成 “TTNPB-PEMT-SAH / 膽堿” 核心代謝網(wǎng)絡(luò)，為神經(jīng)分化提供膜結(jié)構(gòu)原料與氧化還原平衡支持。

為驗(yàn)證 ANSCs 的臨床應(yīng)用潛力，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了慢性不可預(yù)測溫和應(yīng)激（CUMS）+ 脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的抑郁模型大鼠，將 tdTomato 標(biāo)記的 ANSCs 或傳統(tǒng) NSCs 通過立體定向注射到大鼠海馬區(qū)。結(jié)果顯示，移植后 7 天，ANSCs 在大鼠海馬區(qū)成功定植并存活，且存活數(shù)量顯著多于傳統(tǒng) NSCs；行為學(xué)檢測證實(shí)，ANSCs 移植組大鼠體重下降幅度減小，蔗糖偏好率顯著提升，曠場試驗(yàn)總移動(dòng)距離、高架十字迷宮開臂停留時(shí)間均恢復(fù)至接近正常水平，抑郁樣行為得到顯著改善；分子機(jī)制上，移植后大鼠海馬區(qū)炎癥水平降低（脾指數(shù)下降），轉(zhuǎn)錄組特征向正常對照組靠攏，證實(shí) ANSCs 可通過調(diào)節(jié)海馬微環(huán)境、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等方式發(fā)揮治療作用。

該研究首次建立了 “雙小分子協(xié)同 + 化學(xué)成分明確” 的 ANSCs 誘導(dǎo)體系，系統(tǒng)闡明了 TTNPB 與 CHIR99021 通過 “表觀遺傳重塑 - 代謝重編程” 協(xié)同驅(qū)動(dòng) hPSC 向神經(jīng)干細(xì)胞分化的核心機(jī)制：TTNPB 作為 “表觀遺傳調(diào)節(jié)劑”，增強(qiáng)神經(jīng)分化基因的染色質(zhì)可及性，放大 CHIR99021 的神經(jīng)誘導(dǎo)效應(yīng)；同時(shí)，二者協(xié)同激活 SAH / 膽堿代謝網(wǎng)絡(luò)，為神經(jīng)命運(yùn)決定提供內(nèi)在能量與物質(zhì)支持。誘導(dǎo)的 ANSCs 不僅具備 “高效分化、長期增殖、安全無毒” 的技術(shù)優(yōu)勢，更在抑郁模型中展現(xiàn)出顯著治療效果，為神經(jīng)疾病的細(xì)胞治療提供了全新的種子細(xì)胞來源。此外，該研究還為細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換的機(jī)制研究提供了新范式 —— 首次揭示 RA 信號在神經(jīng)分化中的 “表觀遺傳 - 代謝” 雙重調(diào)控作用，為后續(xù)小分子誘導(dǎo)體系的優(yōu)化提供了理論依據(jù)。未來，隨著該體系的進(jìn)一步完善，有望在阿爾茨海默病、脊髓損傷等更多神經(jīng)疾病模型中開展驗(yàn)證，加速干細(xì)胞療法的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202515648

制版人：十一

BioArt

Med

Plants

人才招聘

學(xué)術(shù)合作組織

（*排名不分先后）

轉(zhuǎn)載須知

【非原創(chuàng)文章】本文著作權(quán)歸文章作者所有，歡迎個(gè)人轉(zhuǎn)發(fā)分享，未經(jīng)作者的允許禁止轉(zhuǎn)載，作者擁有所有法定權(quán)利，違者必究。