撰文 |章臺(tái)柳

多發(fā)性硬化癥（ MS ）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（ CNS ）的炎癥性脫髓鞘疾病，其中 T 細(xì)胞深度參與其病理過程。 CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞均被發(fā)現(xiàn)存在于 MS 病灶的血管周圍間隙以及腦實(shí)質(zhì)中。相對(duì)于 CD4+ T 細(xì)胞， CD8+ T 細(xì)胞在 MS 病灶中富集并發(fā)生克隆性擴(kuò)增，這表明存在局部抗原驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)增。特定的主要組織相容性復(fù)合體（ MHC ） I 類等位基因也會(huì)改變 MS 的易感性，這進(jìn)一步支持了細(xì)胞毒性 CD8?T 細(xì)胞在 MS 生物學(xué)中的關(guān)鍵作用。獲取中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織以分析MS中的浸潤性T細(xì)胞反應(yīng)是侵入性的，并且很少在疾病早期進(jìn)行。腦脊液（CSF）是淋巴細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中轉(zhuǎn)站，為了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部的免疫反應(yīng)提供了一個(gè)窗口。對(duì)腦脊液免疫細(xì)胞庫的研究確實(shí)表明，其與MS病灶中擴(kuò)增的T細(xì)胞群體存在高度的克隆重疊。這就為識(shí)別在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中獨(dú)特?cái)U(kuò)增的 T 細(xì)胞，尤其是 CD8+ T 細(xì)胞，并確定其表型特征和抗原特異性，提供了可行性。

近日 ，來自 加利福尼亞大學(xué)舊金山分校的 Joseph J. Sabatino Jr 和 Scott S. Zamvil 團(tuán)隊(duì)合作 在 Nature Immunology 雜 志上發(fā)表文章 Antigen specificity of clonally enriched CD8+ T cells in multiple sclerosis ，通過對(duì)MS隊(duì)列和對(duì)照組個(gè)體的腦脊液及血液進(jìn)行全面的單細(xì)胞RNA測(cè)序和T細(xì)胞受體測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了一組23個(gè)高度擴(kuò)增且高度活化的CD8+ T細(xì)胞克隆型，這些克隆型主要在MS隊(duì)列的腦脊液中富集。通過無偏倚和靶向抗原發(fā)現(xiàn)方法，鑒定出六種識(shí)別EB病毒（EBV）抗原及多種新型模擬表位的CD8+ T細(xì)胞克隆型。盡管大多數(shù)模擬表位未能引發(fā)功能性免疫應(yīng)答，但從MS患者中發(fā)現(xiàn)的三種擴(kuò)增CD8+ T細(xì)胞受體對(duì)EBV具有反應(yīng)性。在腦脊液中檢測(cè)到EBV DNA和轉(zhuǎn)錄本，包括在那些具有高度擴(kuò)增的EBV特異性CD8+ T細(xì)胞的MS患者中。這些發(fā)現(xiàn)為理解CD8+ T細(xì)胞在MS中的作用提供了重要啟示，并支持EBV在MS免疫病理學(xué)中的重要作用。

研究共招募了18名個(gè)體——11名復(fù)發(fā)緩解型MS患者，2名臨床孤立綜合征（CIS）患者，2名其他神經(jīng)炎癥性疾?。∣ND）患者和3名健康對(duì)照（HCs）。MS和CIS（MS/CIS）隊(duì)列中的所有患者在樣本采集時(shí)均未接受過治療（即，既往無免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制劑治療史），但一名OND患者 正在接受TNF-α抑制劑免疫治療 。每位參與者在同一天采集配對(duì)外周血和腦脊液樣本。對(duì)新鮮獲取的、包含所有未分離細(xì)胞亞群的樣本，使用10X Genomics 5'建庫試劑盒進(jìn)行配對(duì)的scRNA-seq和scTCR-seq，以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表型和TCR克隆分析的結(jié)合。scRNA - seq分析顯示，與 HC/OND 隊(duì)列相比， MS/CIS 患者中的 CD8+ 和 CD4+ T 細(xì)胞都處于更活化的狀態(tài)，效應(yīng)功能和歸巢能力增強(qiáng)。相對(duì)應(yīng)的， MS/CIS 患者的血液和腦脊液中存在更多樣化的 CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞克隆型。分析克隆擴(kuò)增的情況，發(fā)現(xiàn)在腦脊液中觀察到小部分克隆擴(kuò)增的 CD4+ T 細(xì)胞，但在 MS/CIS 組和 HC/OND 組中總體上高度和中度擴(kuò)增的 CD8+ T 細(xì)胞的比例類似。雖然只有1 .5% 的克隆型在兩個(gè)部位同時(shí)存在，但進(jìn)一步提取出在腦脊液中富集擴(kuò)增的T細(xì)胞克隆型（其腦脊液頻率至少是同一個(gè)體外周血頻率兩倍的克隆型），鑒定出33個(gè)高度腦脊液富集且擴(kuò)增的T細(xì)胞克隆型，它們?cè)谀X脊液中的頻率約為外周血頻率的2倍到超過100倍不等。結(jié)合scRNA - seq分析基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腦脊液中高度克隆擴(kuò)增的T細(xì)胞表達(dá)的基因特征提示其具有豐富的抗原經(jīng)歷、細(xì)胞毒性以及獨(dú)特的組織歸巢能力。

隨后，研究人員探究高度擴(kuò)增的腦脊液富集 CD8+ T 細(xì)胞所識(shí)別的抗原。首先利用肽：MHC（pMHC）酵母展示文庫，該文庫在給定的 MHC 等位基因上展示約 1-10×10? 個(gè)隨機(jī)肽段，用于探測(cè)單個(gè) TCR 的識(shí)別情況。盡管這種無偏倚的抗原發(fā)現(xiàn)方法產(chǎn)生了幾個(gè)CD 8+ T細(xì)胞克隆型的新穎模擬表位，這些表位可通過pMHC I四聚體結(jié)合檢測(cè)到，但均未對(duì)天然存在的抗原表現(xiàn)出功能性反應(yīng)性。其次，研究人員在幾個(gè)公共TCR數(shù)據(jù)庫中查詢高度擴(kuò)增的腦脊液富集TCR克隆型。發(fā)現(xiàn)來自參與者 MS8 的一個(gè) CD8 + T 細(xì)胞克隆型（ 86333_1456 ）與一個(gè)被充分描述的 EB 病毒（ EBV ）表位 EBNA3A 193-201 （ FLRGRAYGL ）的 TCRα 和β序列完全匹配，并且pMHC I四聚體分析驗(yàn)證其特異性，且能夠被相關(guān)EBV肽段刺激并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞因子，即證明了具有功能。進(jìn)一步分析顯示，在 MS 患者的腦脊液中，至少有三種高度擴(kuò)增的 CD8+ T 細(xì)胞對(duì) EBV 具有特異性，但大多數(shù)富集 T 細(xì)胞克隆型的特異性仍然未知，且 EBV 特異性 CD8+ T 細(xì)胞擴(kuò)增在 MS 患者的腦脊液中（相比血液）特異增加。將這三種腦脊液擴(kuò)增的 CD8+ T 細(xì)胞克隆型的轉(zhuǎn)錄特征與所有其他腦脊液擴(kuò)增和富集的 CD8+ T 細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)腦脊液中 EBV 擴(kuò)增的 CD8+ T 細(xì)胞是與濾泡歸巢和 B 細(xì)胞相互作用相關(guān)的效應(yīng)細(xì)胞群。在測(cè)試的自身抗原肽段中，未呈現(xiàn)出自身抗原交叉反應(yīng)性。說明這些克隆擴(kuò)增的CD 8+ T細(xì)胞在腦脊液中的富集可能是由對(duì)EBV的反應(yīng)性驅(qū)動(dòng)的。

那么，EBV是否存在于腦脊液中？從所有參與者的腦脊液中提取DNA，并用EBV BZLF1基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在6/13的MS/CIS樣本和2/5的HC/OND樣本中檢測(cè)到EBV DNA。通過數(shù)字PCR（ddPCR）擴(kuò)增EBER2基因來進(jìn)一步量化EBV DNA的存在，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的患者和對(duì)照研究參與者的腦脊液中都檢測(cè)到了EBV，盡管其相對(duì)豐度差異很大，其中MS/CIS患者的水平最高。對(duì)幾種潛伏期和裂解期基因的EBV轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在 MS/CIS 隊(duì)列（包括腦脊液中存在高度擴(kuò)增的 EBV 特異性 CD8? T 細(xì)胞的患者 MS6 、 MS8 和 MS27 ）中觀察到 BamHI-W 轉(zhuǎn)錄本顯著增加，其他潛伏期和早期裂解基因在兩組間沒有差異。這表明 MS/CIS 患者腦脊液中 EBV 再激活增強(qiáng)，可能驅(qū)動(dòng)了 EBV 特異性 CD8? T 細(xì)胞的擴(kuò)增。

https://www.nature.com/articles/s41590-025-02412-3

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