【背景&引言】

隨著高原旅行、登山探險(xiǎn)及特殊環(huán)境作業(yè)日益頻繁，人體暴露于低壓缺氧環(huán)境所引發(fā)的急性肺損傷，已成為不容忽視的醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)。高原肺水腫（HAPE）發(fā)病急、進(jìn)展快，嚴(yán)重時(shí)可危及生命，而目前臨床上仍缺乏特異性的防治藥物。芍藥苷（Paeoniflorin, Pae）是中藥芍藥的核心活性成分，既往研究已顯示其具有顯著的抗炎、抗氧化及器官保護(hù)活性。然而，芍藥苷是否能夠緩解高原缺氧引起的急性肺損傷，以及其具體機(jī)制并不明確。

2025年12月20日，北京市放射醫(yī)學(xué)研究所高月院士團(tuán)隊(duì)在藥學(xué)權(quán)威期刊《Acta Pharmaceutical Sinica B》上發(fā)表了文章“Paeoniflorin alleviates hypobaric hypoxia-triggered lung injury through targeting MEK2 to modulate ERK2–SGK1 signaling”，綜合運(yùn)用體內(nèi)外模型、蛋白質(zhì)組學(xué)、計(jì)算生物學(xué)與基因編輯等技術(shù)，首次完整闡明了芍藥苷通過直接靶向MEK2蛋白，調(diào)控ERK2–SGK1信號(hào)軸，進(jìn)而維持線粒體穩(wěn)態(tài)、緩解肺損傷的分子機(jī)制。

主要研究策略：

1. 表型確認(rèn)與機(jī)制初篩

2. 芍藥苷的作用機(jī)制分析

3. 直接靶點(diǎn)MEK2的發(fā)現(xiàn)與結(jié)合驗(yàn)證

4. 靶點(diǎn)MEK2的功能驗(yàn)證

5. 下游通路信號(hào)軸MEK2-ERK2-SGK1解析

6. 核心表型機(jī)制的閉環(huán)驗(yàn)證

01

在模擬高原環(huán)境的低壓缺氧小鼠模型中，Pae能顯著減輕肺水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡結(jié)構(gòu)損傷，并降低肺組織與血清中促炎因子（IL-1β,IL-6,TNF-α）水平。進(jìn)一步的肺組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，Pae可逆轉(zhuǎn)缺氧引起的差異蛋白表達(dá)譜，這些蛋白主要富集于炎癥反應(yīng)、活性氧代謝及細(xì)胞凋亡通路。關(guān)鍵蛋白如NCF1、MMP8、LCN2和MCL1的異常表達(dá)在Pae干預(yù)后得到糾正，提示其通過調(diào)控氧化應(yīng)激與炎癥網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮保護(hù)作用。

Figure 1 Pae ameliorates hypobaric hypoxia-induced lung injury.

圖1 芍藥苷改善低壓缺氧誘導(dǎo)的肺損傷。

Figure 2 Proteomics reveals that Pae inhibits hypobaric hypoxia-induced reactive oxygen species generation and inflammatory response in lung tissue.

圖2 蛋白質(zhì)組學(xué)揭示芍藥苷抑制低壓缺氧誘導(dǎo)的肺組織活性氧生成與炎癥反應(yīng)。

02

在CoCl?誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HPMEC）缺氧模型中，Pae處理顯著提升細(xì)胞活力，抑制凋亡。機(jī)制上，Pae能降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平與活性氧（ROS）積累，并逆轉(zhuǎn)鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物：降低總鐵與Fe2?含量，上調(diào)GPX4蛋白表達(dá)。同時(shí)，Pae有效改善線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，提升線粒體膜電位（MMP）與氧消耗率（OCR），并調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白（如DRP1↓,MFN2↑,OPA1↑）的表達(dá)，表明其通過維護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)與功能完整性抵抗缺氧損傷。

Figure 3 Pae inhibits hypoxia-induced oxidative stress, inflammatory response, and ferroptosis in vitro.

圖3 芍藥苷在體外抑制缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及鐵死亡。

Figure 4 Pae improves mitochondrial function and inhibits hypoxia-induced structural damage and dysfunction of mitochondria in vitro.

圖4 芍藥苷在體外改善線粒體功能并抑制缺氧誘導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)損傷與功能障礙。

03

為闡明Pae的直接作用靶點(diǎn)，研究采用限制性蛋白酶解-質(zhì)譜（LiP-MS）進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)MEK2蛋白與Pae結(jié)合顯著。并進(jìn)一步通過CETSA、DARTS、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬(MDS)、SPR和MST進(jìn)行了驗(yàn)證。CETSA和DARTS結(jié)果表明，Pae可以緩解MEK2的熱降解和蛋白酶介導(dǎo)的非特異性降解。通過分子對(duì)接與動(dòng)力學(xué)模擬，精確定位Pae結(jié)合于MEK2的三個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基：Lys101、Asp156和Ser198。表面等離子共振（SPR）與微量熱泳動(dòng)（MST）實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者具有高親和力。隨后研究人員將上述位點(diǎn)突變后，Pae與MEK2的結(jié)合能力大幅下降，確證了這些位點(diǎn)是Pae與MEK2直接互作的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

Figure 5 Chemical proteome reveals MEK2 protein as a target of Pae.

圖5 化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)揭示MEK2蛋白是芍藥苷的作用靶點(diǎn)。

0

4

為驗(yàn)證Pae的效應(yīng)是否依賴于MEK2，研究使用MEK2抑制劑U0126或在細(xì)胞中敲低MEK2表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制MEK2活性可完全拮抗Pae的細(xì)胞保護(hù)作用：Pae對(duì)線粒體膜電位（MMP）的提升、對(duì)谷胱甘肽（GSH）水平的恢復(fù)、以及對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）異常開放的抑制作用均被取消。同時(shí)，MEK2敲低顯著削弱了Pae對(duì)下游ERK2磷酸化及SGK1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，并加劇了脂質(zhì)過氧化與炎癥因子表達(dá)，證明MEK2是Pae發(fā)揮效應(yīng)的必要靶點(diǎn)。

Figure 6 U0126 causes mitochondrial damage, mPTP opening, lipid peroxidation, and ferroptosis in vitro.

圖6 U0126在體外導(dǎo)致線粒體損傷、mPTP開放、脂質(zhì)過氧化及鐵死亡。

Figure 7 Knockdown of MEK2 in HPMEC cells causes mitochondrial damage, induces mPTP opening and aggravates lipid peroxidation.

圖7 在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲低MEK2導(dǎo)致線粒體損傷、誘導(dǎo)mPTP開放并加劇脂質(zhì)過氧化。

05

進(jìn)一步探究下游機(jī)制發(fā)現(xiàn)，Pae通過促進(jìn)MEK2與ERK2的蛋白互作，增強(qiáng)ERK2磷酸化?；罨腅RK2進(jìn)而上調(diào)SGK1的表達(dá)。使用SGK1抑制劑（EMD683638）可阻斷Pae及ERK2激動(dòng)劑（LM22B）對(duì)氧化應(yīng)激、mPTP開放及細(xì)胞凋亡的改善作用，證實(shí)SGK1是該通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子。另一方面，在細(xì)胞中過表達(dá)MEK2可模擬Pae的保護(hù)效果，并增強(qiáng)ERK2-SGK1信號(hào)，進(jìn)一步支持該軸的核心地位。

Figure S6Inhibition of SGK1 in HPMEC cells induces oxidative stress, promotes mPTP opening, apoptosis and inflammatory responses.
圖S6 在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中抑制SGK1可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、促進(jìn)mPTP開放、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。

Figure 8 MEK2 overexpression suppresses lipid peroxidation and mPTP opening, and improves mitochondrial biogenesis.

圖8 MEK2過表達(dá)抑制脂質(zhì)過氧化和mPTP開放，并改善線粒體生物合成。

06

最后，在整體動(dòng)物水平進(jìn)行驗(yàn)證。給予MEK2抑制劑U0126可加劇缺氧小鼠的肺組織炎癥、氧化損傷與鐵死亡，并抵消Pae的保護(hù)作用。更為關(guān)鍵的是，利用腺相關(guān)病毒（AAV）構(gòu)建肺血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性MEK2敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)在MEK2缺失的情況下，Pae無法改善缺氧引起的肺病理?yè)p傷、脂質(zhì)過氧化、鐵蓄積及線粒體功能障礙。這最終在體內(nèi)證明，Pae的肺保護(hù)作用完全依賴于內(nèi)皮細(xì)胞中的MEK2，并通過激活ERK2-SGK1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

Figure 9 Pae activates the MEK2–ERK2–SGK1 axis in vivo to ameliorate mitochondrial dysfunction and alleviate hypobaric hypoxic lung injury.

圖9 芍藥苷在體內(nèi)激活MEK2–ERK2–SGK1軸以改善線粒體功能障礙并緩解低壓缺氧肺損傷。

Figure 10 Knockdown of MEK2 in pulmonary vascular endothelial cells abolished the lung injury protective effect of Pae.

圖10 在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲低MEK2取消了芍藥苷的肺損傷保護(hù)作用。

【小結(jié)】

文章中研究人員利用多學(xué)科技術(shù)方法，最終闡明了芍藥苷緩解低壓缺氧肺損傷的完整信號(hào)通路：Pae→結(jié)合MEK2→促進(jìn)MEK2-ERK2互作→激活ERK2磷酸化→上調(diào)SGK1→維持線粒體穩(wěn)態(tài)→抑制氧化應(yīng)激/炎癥/鐵死亡。在藥靶分析策略上，首先通過LiP-MS在非標(biāo)記、近生理?xiàng)l件下篩選出MEK2為潛在靶點(diǎn)；進(jìn)而借助分子對(duì)接與動(dòng)力學(xué)模擬精確定位其結(jié)合殘基（K101、D156、S198）；在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用CETSA、DARTS、SPR、MS證實(shí)Pae與MEK2的高親和力互作；最后通過點(diǎn)突變構(gòu)建、基因敲降/過表達(dá)及藥理學(xué)抑制等功能實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞與動(dòng)物模型中確認(rèn)MEK2是Pae發(fā)揮肺保護(hù)作用的必要靶點(diǎn)。這一完整的“從組學(xué)篩選到功能驗(yàn)證”靶點(diǎn)鑒定策略，不僅清晰揭示了Pae的直接作用靶點(diǎn)與信號(hào)通路，也為天然產(chǎn)物的機(jī)制研究提供了方法學(xué)參考。

<參考文獻(xiàn)> DOI:10.1016/j.apsb.2025.12.024