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Abstract

毛蕊異黃酮是黃芪中的主要活性成分，具有治療動脈粥樣硬化（AS）的潛力。本研究利用高脂飲食飼養(yǎng)的ApoE–/–小鼠模型，探討了毛蕊異黃酮對膽汁酸（BA）代謝和腸道菌群的作用。結果顯示，毛蕊異黃酮可顯著降低血清膽固醇和甘油三酯水平，減輕動脈斑塊形成和肝臟脂質沉積。同時，它改善了因高脂飲食導致的腸道菌群失衡，提高了有益菌比例，并顯著調節(jié)多種膽汁酸水平。機制上，毛蕊異黃酮可下調肝臟FXR蛋白、上調CYP7A1和膽固醇外排相關轉運蛋白，抑制膽汁酸重吸收，促進排泄，從而減輕肝臟膽固醇積累。糞菌移植實驗也證實，毛蕊異黃酮改善的菌群結構足以緩解AS。本研究揭示了毛蕊異黃酮通過“腸道菌群–膽汁酸”代謝軸發(fā)揮抗AS作用的新機制。

Introduction

動脈粥樣硬化（AS）是一種由血脂沉積、炎癥反應和膽固醇代謝障礙引發(fā)的慢性疾病，現有藥物如他汀雖能降脂，但療效有限且存在副作用。近年來，腸道菌群和膽汁酸代謝被認為在AS發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。高脂飲食會破壞腸道屏障、引起菌群失衡和膽汁酸代謝紊亂，進而加重血脂代謝障礙和血管炎癥。因此，調控腸道菌群和膽汁酸代謝被視為治療AS的重要新策略。毛蕊異黃酮作為黃芪的主要異黃酮成分，具有抗氧化、抗炎和調節(jié)免疫等作用，已有研究提示其對血管內皮保護和抑制泡沫細胞形成有效。本研究重點探討毛蕊異黃酮能否通過調控膽汁酸代謝及腸道菌群互作來改善AS，并結合代謝組學、16S rRNA測序及分子機制分析，為其作為潛在功能性成分治療AS提供依據。

Results

毛蕊異黃酮改善高脂飲食誘導的ApoE–/–小鼠AS

作者評估了毛蕊異黃酮對ApoE–/–小鼠AS模型的治療作用（圖1A）。結果顯示，經過16周高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的小鼠體質量相比對照組有所增加，但各組之間變化不顯著；毛蕊異黃酮干預組的小鼠體質量低于HFD組（圖1B）。毛蕊異黃酮可能通過調節(jié)載脂蛋白E相關機制緩解動脈粥樣斑塊形成。主動脈整體油紅O染色結果顯示（圖1C），對照組主動脈未見明顯脂質沉積，而HFD組出現明顯紅色脂質斑塊，斑塊面積顯著增加。毛蕊異黃酮干預顯著減小主動脈斑塊面積。在HE染色結果中（圖1D），對照組主動脈內膜結構清晰完整，細胞排列整齊，無明顯異常；HFD組主動脈內壁不平滑，出現明顯粥樣斑塊和炎癥細胞浸潤，斑塊附著部位血管內膜增厚且結構紊亂，伴隨中膜增生。辛伐他汀組血管層次結構清晰，但部分血管壁增厚，平滑肌細胞胞質松散、染色淺。毛蕊異黃酮組血管內壁較HFD組光滑度改善，斑塊沉積減少，炎癥細胞浸潤和血管壁厚度明顯改善，高劑量效果優(yōu)于低劑量。血清指標方面，HFD誘導明顯高膽固醇血癥和高脂血癥，血清TC、LDL-C和TG顯著升高，HDL-C顯著下降（圖1E）。毛蕊異黃酮干預可顯著降低TC、LDL-C、TG水平，高劑量對HDL-C改善明顯，提示毛蕊異黃酮可減輕脂質沉積并調控血脂水平。

毛蕊異黃酮對肝臟的保護作用

肝臟是機體脂質代謝的重要器官，其脂質沉積水平可反映動脈內膜脂質沉積。HFD喂養(yǎng)可增加血液游離脂肪酸，引起肝臟脂質合成增加。HE染色顯示（圖1F），對照組肝小葉結構正常，肝細胞排列整齊，無明顯炎癥變化；HFD組肝細胞出現輕度脂肪變性，胞質內出現小圓形空泡，少量氣球樣變性，伴有細胞腫脹、胞質空泡化，多數泡沫細胞浸潤及輕度膽管增生。毛蕊異黃酮或辛伐他汀處理組肝臟脂肪病變及炎癥有所緩解，僅部分肝細胞出現輕度水樣變性、細胞腫脹、胞質松散及染色淺。肝臟油紅O染色顯示（圖1G），對照組肝臟無紅色脂滴沉積，HFD組肝臟脂滴明顯增多，毛蕊異黃酮干預后肝臟脂滴沉積顯著減少。血清ALT和AST水平（圖1E）顯示，HFD組明顯升高，毛蕊異黃酮低高劑量均可降低，表明其可顯著改善HFD引起的肝損傷并減輕肝臟脂質沉積。值得注意的是，辛伐他汀組血清ALT未見明顯改善，提示其在治療AS過程中對肝損傷作用有限。

圖1 毛蕊異黃酮對HFD誘導的ApoE–/–小鼠的作用

毛蕊異黃酮重塑腸道菌群

腸道菌群結構及腸道通透性與AS及其風險因素密切相關。通過16S rRNA測序分析小鼠盲腸內容物菌群結構，α-多樣性指標顯示（圖2A），HFD組Chao1、ACE、Observed_species、Shannon和Simpson指數均低于對照組，提示HFD降低腸道菌群豐富性和多樣性。毛蕊異黃酮干預組Chao1、ACE、Observed_species和Shannon指數顯著高于HFD組，Simpson指數有所提高但差異不顯著，表明毛蕊異黃酮可改善AS小鼠腸道菌群多樣性和豐富性。β-多樣性分析（PCoA、NMDS，圖2B）顯示，HFD組與對照組距離較遠，表明HFD改變了腸道菌群結構，毛蕊異黃酮組與對照組距離最接近，提示其改善腸道菌群組成。門水平分析顯示（圖2C-D），HFD降低Bacteroidetes/Firmicutes比例，同時增加Desulfobacterota、Deferribacterota、Proteobacteria豐度，毛蕊異黃酮干預可逆轉這些變化，提高Bacteroidetes/Firmicutes比例，降低致病菌豐度。在屬水平上（圖2E-F），HFD增加Bilophila、Alistipes、Oscillibacter和Desulfovibrio豐度，減少Bacteroides、Lactobacillus和Odoribacter豐度，毛蕊異黃酮可顯著逆轉上述變化。LEfSe分析（圖2G-H）進一步顯示，毛蕊異黃酮可增加Muribaculum、Peptococcus、Rodentibacter等益生菌豐度，減少致病菌，調控腸道菌群結構，促進腸道免疫穩(wěn)態(tài)，有利于AS防治。

圖2 毛蕊異黃酮重構ApoE–/–小鼠腸道菌群組成

毛蕊異黃酮調控小腸膽汁酸代謝

通過UPLC-MS/MS檢測盲腸40種膽汁酸（BAs）含量。HFD組總BAs水平升高，結合型/游離型膽汁酸比例下降，二級/初級膽汁酸比例升高（圖3A）。毛蕊異黃酮可降低二級/初級膽汁酸比例，調節(jié)異常膽汁酸升高，但對結合型/游離型比例影響不顯著。10種膽汁酸顯著變化（圖3B），HFD降低CDCA和TCA水平，增加LCA、DCA及部分結合型膽汁酸（GDCA、TLCA）水平，毛蕊異黃酮干預后這些水平明顯調節(jié)，提示其可改善膽汁酸代謝異常。TLCA/CDCA比例HFD組升高，GDCA/DCA、TDCA/DCA、TCDCA/CDCA比例升高，而毛蕊異黃酮顯著降低這些比例（圖3C），表明其可通過調節(jié)二級膽汁酸的甘氨酸和?；撬峤Y合反應改善膽汁酸代謝。同時，菌群與膽汁酸相關性分析（圖3D）顯示，Bilophila、Parasutterella、Butyricicoccus、Desulfovibrio與TDCA、GDCA、TLCA正相關，Lactobacillus負相關，說明毛蕊異黃酮通過改善腸道優(yōu)勢菌群影響膽汁酸代謝。

圖3毛蕊異黃酮改善腸內膽汁酸代謝紊亂

毛蕊異黃酮通過調控肝臟膽汁酸代謝相關關鍵基因減少脂質沉積

RT-qPCR和Western blot分析肝臟膽汁酸代謝相關基因及蛋白水平（圖4A-B）顯示，HFD組FXR上調，TGR5、ABCA1、ABCG1、CYP7A1下調，毛蕊異黃酮可恢復這些變化。FXR/TGR5信號通路與腸道菌群密切相關，毛蕊異黃酮可激活FXR，抑制肝臟脂質吸收，促進膽汁酸合成及腸肝循環(huán)，從而改善AS。

毛蕊異黃酮通過調節(jié)腸道膽汁酸轉運關鍵基因減輕腸道炎癥

HFD可誘導局部腸道炎癥，破壞腸屏障，提高通透性，進而引發(fā)全身炎癥或脂質代謝紊亂，加重AS（圖4C）。毛蕊異黃酮可減少HFD誘導的腸道結構破壞及炎癥細胞浸潤。HFD上調腸道ABST轉錄水平，毛蕊異黃酮顯著降低ABST，同時抑制回腸FXR表達，增加TGR5表達（圖4D-E），促進膽固醇向膽汁酸轉化，維持膽固醇穩(wěn)態(tài)。對Ostα、Ostβ影響不顯著，提示毛蕊異黃酮主要通過TGR5激活和ABST抑制改善膽汁酸循環(huán)，保護腸道屏障。

圖4毛蕊異黃酮對膽汁酸合成與轉運相關基因/蛋白的調控

糞菌移植（FMT）改善HFD誘導的AS

為了驗證毛蕊異黃酮作用是否依賴腸道菌群，進行FMT實驗（圖5A）。接受毛蕊異黃酮處理供體腸道菌群的小鼠，主動脈斑塊顯著縮小，血清TC、LDL-C、TG降低（圖5B-C），肝臟病理改善、脂質沉積減少（圖5D）。菌群多樣性提高（圖5E），Oscillibacter、Bacteroides豐度增加，Alistipes下降（圖5F-H），膽汁酸UDCA、LCA、TUDCA、TDCA水平下降（圖5I），提示毛蕊異黃酮對膽汁酸的調節(jié)作用依賴腸道菌群。

圖5毛蕊異黃酮處理供體糞菌移植改善AS小鼠

Conclusion

綜上所述，毛蕊異黃酮可調控ApoE–/–小鼠脂質代謝，增加益生菌比例，降低致病菌豐度，改善菌群結構并增強腸屏障功能，同時調節(jié)膽汁酸組成，提高結合型膽汁酸向游離膽汁酸轉化水平。毛蕊異黃酮抑制腸道FXR/TGR5信號通路，激活肝臟CYP7A1表達，通過負反饋機制進一步抑制肝臟FXR通路，實現肝腸間膽汁酸穩(wěn)態(tài)的平衡（圖6）。這些作用可有效逆轉血脂異常、主動脈及肝臟脂質沉積，同時通過FMT可將腸道菌群調節(jié)作用傳遞至受體小鼠，為AS的臨床預防和治療提供新策略。

圖6 毛蕊異黃酮治療AS的擬議機制

Calycosin improves atherosclerosis by reshaping the interaction between the gut microbiome and bile acid metabolism

Jiaqi Fu, Donghua Yu, Yuqin Liang, Xin Gao, Yunhe Shi, Yu Wang, Pingping Chen, Fang Lu, Shumin Liu*

Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

*Corresponding author.

Abstract

Calycosin, Astragali Radix most prominent ingredient, has drawn more attention as a result of its ability to treat atherosclerosis (AS). However, the mechanism of action has not been fully elucidated. We investigated the effects of calycosin on bile acid (BA) metabolism and gut microbiome in ApoE–/– mice fed a high-fat diet (HFD). The data showed that the aorta of ApoE–/– mice treated with HFD showed significant atheromatous plaque formation and lipid accumulation, and the levels of total cholesterol (TC), triglycerides (TG) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) were significantly increased, while the levels of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) were significantly decreased. Calycosin can substantially regulate lipid levels, thereby alleviating liver lipid deposition induced by atherosclerosis. In addition, 16S rRNA sequencing showed that calycosin treatment has reshaped the gut microbiota disturbed by HFD, in particular, increasing the ratio of Bacteroidetes/Firmicutes, and improving the relative abundance of Bilophila, Desulfovibrio, Bacteroides, Lactobacillus, etc. Meanwhile, targeted metabolomics analysis showed that calycosin treatment significantly modulated glycodeoxycholic acid (CDCA), taurocholic acids (TCA), lithocholic acid (LCA), deoxycholic acid (DCA), taurodeoxycholic acid (TDCA) and BA pool composition, which were associated with atherosclerotic plaque areas. In addition, calycosin treatment also down-regulated farnesoid X receptor (FXR) protein levels and up-regulated cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1 (CYP7A1) protein levels in the hepatic. At the same time, calycosin inhibits the ileum FXR/TGR5 signaling pathway, inhibits BA reabsorption, promotes BA excretion, and reduces hepatic cholesterol accumulation by enterohepatic circulation. In addition, we found that calycosin significantly promoted the expression of hepatic ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) and ABCG1 to mediate cholesterol efflux. Meanwhile, calycosin regulates gut microbiota, and Bacteroides, Alistipes, Desulfovibrio, Lactobacillus, Bilophila and Odoribacter are closely related to specific BAs. This enables us to further understand the relationship between BA metabolism and gut microbiota. Calycosin may reduce high-fat diet-induced hepatic cholesterol accumulation in ApoE–/– mice through gut microbiota and BA metabolism, and play a role in treating AS. Finally, we confirmed that calycosin-altered gut microbiota by fecal microbiota transplantation was sufficient to alleviate atherosclerosis. Taken together, our findings provide important insights into the pharmacological mechanisms underlying the efficacy of calycosin on atherosclerosis.

Reference:

FU J Q, YU D H, LIANG Y Q, et al. Calycosin improves atherosclerosis by reshaping the interaction between the gut microbiome and bile acid metabolism[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(4): 9250085. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250085.

翻譯：王小云（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意

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