LPS 的酰基鏈數(shù)目決定 caspase-4/11 的 CARD 寡聚化

前期的研究 顯示 ，六酰基化的 LPS （如 LPS-Ra ， 一種不含 O- antigen 的 大腸桿菌脂多糖 變體 ）可通過誘導(dǎo)寡聚化來激活 caspase-4/11 ，而低?；闹嗵寝卓箘ㄈ缢孽；? LPS 前體 lipid I V a ）則不能激活 caspase-4/11 的活性。研究者推測脂多糖的酰基化程度決定了 caspase-4/11 是否發(fā)生寡聚化并 激活 其活性。 實(shí)驗(yàn)表明， 從昆蟲細(xì)胞中純化出的 caspase-4 活性 caspase-11 呈現(xiàn)單體狀態(tài)，當(dāng)結(jié)合六酰基化的 LPS-Ra 后，其 聚集 狀態(tài)更接近一個(gè)八聚體，而與 Lipid I V a 結(jié)合后則提示 復(fù)合物呈現(xiàn)更小的寡聚體狀態(tài)。

鑒于 LPS 分子中的 lipid A 部分在不同 革蘭斯 細(xì)菌物種之間存在差異，不僅體現(xiàn)在?；湐?shù)量上，還包括鏈長和支化等其他結(jié)構(gòu)特征，因此研究者將分析范圍從大腸桿菌（ E. coli ） 擴(kuò)展到其他革蘭氏陰性菌的 LPS ，包括 沙門氏菌 、 銅綠假單胞菌 以及 牙齦卟啉單胞菌 。這些細(xì)菌的 lipid A 部分具有化學(xué)性質(zhì)相近的骨架結(jié)構(gòu)，但其?；Ｊ礁鞑幌嗤?。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1）， caspase-4 和 caspase-11 均可被含有 ≥6 條?；?的 LPS 物種有效激活（如 大腸桿菌、 沙門氏菌和銅綠假單胞菌 LPS ），而酰基鏈數(shù)少于 6 的 LPS （如 P. gingivalis 和 R. sphaeroides ）則無法誘導(dǎo) caspase-4 或 caspase-11 的激活。此外，七?；纳抽T氏菌 LPS 所誘導(dǎo)形成的 caspase-4/11 CARD 寡聚體，其分子量與六酰化的大腸桿菌 LPS-Ra 所誘導(dǎo)的寡聚體相當(dāng)。

圖1: 各種 細(xì)菌中不同?；潭鹊闹嗵羌せ頲aspase-4/11的 能力差異。

這些結(jié)果表明，LPS的?；湐?shù)目是決定caspase-4/11的CARD寡聚化及其激活狀態(tài)的關(guān)鍵因素。含有六條或更多?；湹?/strong>LPS物種可促進(jìn)形成更高階的組裝體（很可能為八聚體），從而具備激活非經(jīng)典炎性小體的能力；而?；湐?shù)較少的LPS則傾向于形成不完全的寡聚體，在所測試的條件下不具備活性。

LPS 配體誘導(dǎo) caspase-4/11 的 CARD 發(fā)生結(jié)構(gòu)重排

研究者在 近 期 另一項(xiàng) 研究 中 ，報(bào)道了 LPS 結(jié)合 會 增加全長 caspase-11 的 α- 螺旋 比例并 誘導(dǎo)其結(jié)構(gòu)變化【3】。為了進(jìn)一步評估這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變是否歸因于 CARD 結(jié)構(gòu)域 ， 作者 獲取 caspase-4 和 caspase-11 CARD 蛋白 ， 利用 圓二色譜（ circular dichroism ， CD ）分析 其 在有或無配體 LPS-Ra 與 LPS-Rs 存在的情況下 二級結(jié)構(gòu)分布情況 。 結(jié)果表明， 在無配體條件下， caspase-4 CARD 的 CD 光譜在 210 nm 以上沒有明顯峰值，表明其主要呈無序構(gòu)象。與 LPS-Ra 孵育后， caspase-4 CARD 轉(zhuǎn)變?yōu)橐? α- 螺旋為主的二級結(jié)構(gòu)。 LPS-Rs 可促進(jìn)較小且無活性的 caspase-4 寡聚體組裝，其同樣誘導(dǎo)了類似的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。 caspase-11 CARD 也顯示了類似的配體誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。

綜合來看，這些結(jié)果支持這樣一個(gè)模型：caspase-4和caspase-11的CARD在靜息狀態(tài)下本質(zhì)上是無序的，但在LPS結(jié)合時(shí)發(fā)生α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)寡聚化并觸發(fā)后續(xù)激活。

CARD 的高階組裝對于其 活性 激活是必需的

為了精確研究 caspase-4/11 在 LPS 結(jié)合后的寡聚狀態(tài)， 研究者 使用 非變性 質(zhì)譜（ native mass spectrometry ， nMS ）監(jiān)測 caspase-11 CARD 在有無 LPS-Ra 或 lipid IVa 條件下的組裝情況。 結(jié)果顯示， 在無 LPS 結(jié)合時(shí)， caspase-11 CARD 解析 的分子量 顯示 其主要以 單體形式存在 ；與 LPS-Ra 孵育后，復(fù)合物 峰位于 高分子量區(qū)域， 主要 分布在 在 400–520 kDa 范圍內(nèi)，進(jìn)一步質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析表明，復(fù)合物主要形成八聚體，每個(gè) CARD 單體平均結(jié)合約 2–3 個(gè) LPS-Ra 分子。 與 lipid IVa 孵育的 caspase-11 CARD 非變性質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析顯示 ，該復(fù)合物顯示出與 LPS-Ra 復(fù)合物類似的寬峰重疊特征，但質(zhì)荷比（ m/z ）范圍明顯較低 ， 主要分子量約為 236.6 kDa ，約為 CARD/LPS-Ra 復(fù)合物的一半。這些結(jié)果提示，當(dāng)結(jié)合四?；? lipid IVa 時(shí)， caspase-11 CARD 更可能形成四聚體，而非八聚體或更高階的寡聚體。進(jìn)一步 進(jìn)行 質(zhì)譜光度（ mass photometry ）分析 ， 其結(jié)果與 與 nMS 分析 結(jié)果一致 。

以上 分析 表 明， caspase-4/11 的寡聚狀態(tài)是非經(jīng)典炎癥小體激活的關(guān)鍵決定因素。六酰基 LPS 激動劑可促進(jìn)形成高階 caspase-4/11 CARD 寡聚體（如八聚體），而五酰基或四?；卓箘ㄈ? lipid IVa ）僅誘導(dǎo)較小且無活性的 復(fù)合物 組裝 （如四聚體） 。

C aspase-4/11 CARD 通過 疏水性口袋 結(jié)合 LPS

該課題組 近期的研究發(fā)現(xiàn)， caspase-11 的 CARD 可與多種脂質(zhì)分子相互作用，這些脂質(zhì)具有一種保守的結(jié)構(gòu)特征，即至少含有 14 個(gè)碳原子的?；?3 。這一觀察結(jié)果促使 其 提出假設(shè)：在 CARD 內(nèi)部存在一個(gè)特定的結(jié)構(gòu)模塊，負(fù)責(zé)識別 LPS 的?；?。為驗(yàn)證這一假設(shè)， 其采用 采用了氫 - 氘交換質(zhì)譜（ HDX-MS ）技術(shù)，通過測量主鏈酰胺氫的交換速率來評估蛋白質(zhì)的構(gòu)象動態(tài)性，從而提供關(guān)于溶劑可及性和結(jié)構(gòu)保護(hù)程度的重要信息。

基于大腸桿菌中純化所得的 Caspase-11 CARD 在利用去垢劑去除結(jié)合的脂多糖后仍保持有序的 寡 聚狀態(tài)，因此利用該純化所得蛋白，比較其在有無 LPS 條件下的 HDX 圖譜，可幫助 直接 鑒定 LPS 結(jié)合至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)元件或關(guān)鍵殘基。 HDX-MS 數(shù)據(jù)顯示 ，在無 LPS 結(jié)合狀態(tài)下， caspase-11 CARD 第 25–37 位殘基表現(xiàn)出快速的氘?dāng)z取，而第 4–22 位殘基在時(shí)間依賴性分析中顯示出顯著升高的氘?dāng)z取，提示這些區(qū)域具有高度動態(tài)性并暴露于溶劑中。在與 LPS-Ra 結(jié)合后，這兩個(gè)區(qū)域的氘?dāng)z取均顯著降低，表明它們受到結(jié)構(gòu)保護(hù)，很可能直接參與了與 LPS-Ra 的相互作用。第 78–91 位殘基在有無 LPS-Ra 存在的情況下均表現(xiàn)出較高的氘?dāng)z取速率 ， 提示該區(qū)域無論是否結(jié)合 LPS ，始終處于溶劑暴露且結(jié)構(gòu)較為柔性的狀態(tài)。這一結(jié)果與先前研究一致，即 caspase-11 的 N 端前 80 個(gè)殘基已足以介導(dǎo) LPS 結(jié)合。 此外，研究者之前的研究表明， PGPC 作為近期鑒定的一種內(nèi)源性氧化磷脂，可抑制 caspase-11 的活性。 與 LPS-Ra 類似， PGPC 結(jié)合后同樣降低了第 4–22 位和 25–37 位殘基的氘?dāng)z取，表明 PGPC 很可能與 CARD 內(nèi) 同一疏水口袋結(jié)合。這一共享的結(jié)合位點(diǎn)可能解釋了 PGPC 拮抗 LPS 誘導(dǎo)的 caspase-11 寡 聚化與激活的能力。

對 該兩個(gè)區(qū)域的氨基酸 殘基的序列分析顯示，該區(qū)域包含多個(gè)疏水性殘基，并且在不同物種中的 caspase-4 、 caspase-5 和 caspase-11 之間高度保守。利用 AlphaFold 進(jìn)行的結(jié)構(gòu)建模預(yù)測， 該區(qū)域 殘基在 caspase-11 CARD 中形成 α1 和 α2 兩條螺旋 ，其中的 疏水性殘基共同構(gòu)成了一個(gè)巨大的疏水口袋。該口袋還涉及由第 66–78 位殘基形成的 α5 螺旋，最終形成的疏水口袋長度約 20 ? 、寬約 14 ? 、深約 8 ? ，體積足以容納多達(dá)四條 LPS 的酰基鏈 ，針對該區(qū)域的疏水氨基酸進(jìn)行 親水突變分析，相關(guān)突變體則呈現(xiàn)單體狀態(tài)或單體與寡聚體的混合狀態(tài)，表明其 LPS 結(jié)合能力受損、寡聚化過程被破壞 。 值得注意的是， 盡管其中部分疏水殘基在 caspase-1 CARD 中也具有保守性，但在該背景下并未形成類似的口袋結(jié)構(gòu)，提示這一結(jié)構(gòu)特征特異存在于非經(jīng)典炎性半胱天冬酶 caspase-4 和 caspase-11 中。

綜上，可以得出結(jié)論：由第4–37位殘基及α5螺旋相關(guān)殘基共同形成的疏水口袋，是介導(dǎo)caspase-4/11與LPS及其他脂質(zhì)配體相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件。

多個(gè)相互作用界面 介導(dǎo) caspase-4/11 CARD 寡聚化

為探究 caspase-4/11 在激活過程中 介導(dǎo) 寡聚化的 相互作用界面 ， 作者 利用 單殘基分辨率的交聯(lián)質(zhì)譜（ XL-MS ）方法 進(jìn)行分析，即 利用化學(xué)交聯(lián)劑捕獲由 LPS 誘導(dǎo)形成的 caspase-11 CARD 寡聚體中特異性接觸 界面附近的賴氨酸殘基 。 通過對 caspase-11 CARD 的寡聚體和突變單體進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比分析，作者共鑒定出 K9–K62 及 K44–K64 和 K38–K67 等多個(gè)亞基間交聯(lián)肽段 ，提示該些氨基酸及其周圍區(qū)域構(gòu)成了 caspase-11 寡聚化過程中 CARD-CARD 相互作用界面。 針對該幾個(gè)區(qū)域的相關(guān)氨基酸殘基進(jìn)行突變， caspase-11 CARD 寡聚化被破壞或者削弱。 隨后， 研究者 采用類似的方法研究了 caspase-4 CARD 的寡聚化機(jī)制 ， 在 caspase-4 CARD/LPS-Ra 復(fù)合物中檢測到涉及 K8/9–K53/K64 、 K9–K49 以及 K49–K64 的交聯(lián)，這些對應(yīng)于在 caspase-11 CARD 中觀察到的 K9–K62 和 K44–K64 亞基間交聯(lián)。而與 K38–K67 對應(yīng)的交聯(lián)在 caspase-4 CARD 中未被檢測到，可能是由于對應(yīng)區(qū)域缺乏賴氨酸殘基。綜上，我們的 XL-MS 數(shù)據(jù)證實(shí)了 LPS 結(jié)合后 caspase-4/11 CARD 寡聚體的形成，并鑒定了可能介導(dǎo) CARD–CARD 寡聚化的潛在相互作用界面 ，這些界面在 caspase-4 和 caspase-11 里面高度保守。

總結(jié)

C aspase-4/11 非經(jīng)典炎性小體僅由一種蛋白組成，并同時(shí)兼具受體和效應(yīng)器功能。 CARD 是一種研究較為深入的蛋白模塊，在多種細(xì)胞死亡通路（包括焦亡、程序性壞死和凋亡）中發(fā)揮關(guān)鍵作用。迄今為止，已鑒定出數(shù)百種 CARD 或含 CARD 的蛋白，其中大多數(shù)作為蛋白 – 蛋白相互作用模塊，介導(dǎo)信號體的組裝及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo) ， 為促進(jìn)此類信號體的形成，許多 CARD 已知可組裝成絲狀結(jié)構(gòu) 。 本研究 表明 ， caspase-4/11 的 CARD 在與六酰化 LPS 結(jié)合后發(fā)生高階寡聚化，形成八聚體復(fù)合物，這很可能代表非經(jīng)典炎性小體激活所需的最小功能單元。 盡管 caspase-4/11 CARD 與其他 CARD 具有較高的序列相似性，它們卻形成了一種結(jié)構(gòu)上明顯不同的組裝方式，并未觀察到絲狀結(jié)構(gòu)的形成。通過 XL-MS ，在 caspase-4/11 CARD 寡聚體中鑒定出若干潛在的亞基間交聯(lián)區(qū)域，這些潛在接觸 面 并未完全保留 caspase-1 CARD 寡聚體中已知的 I/II/III 型界面，提示 caspase-4/11 CARD 采用了一種獨(dú)特的組裝機(jī)制。相關(guān) 數(shù)據(jù)支持一種潛在的相互作用模型：單個(gè) caspase-4/11 CARD 的疏水口袋可能不足以容納一個(gè) LPS 分子的全部酰基鏈， LPS 的結(jié)合由多個(gè) CARD 協(xié)同完成，一個(gè) LPS 分子的?；溈赏瑫r(shí)與多個(gè) CARD 相互作用。 LPS 作為一種 脂質(zhì) 支架或 “ 分子膠水 ” ，將多個(gè) CARD 聚集在一起，從而促進(jìn)寡聚化。

總之， 該 研究揭示了一種不同于經(jīng)典絲狀 CARD 寡聚體的、由脂 多糖 驅(qū) 動的組裝機(jī)制，為理解非經(jīng)典炎性小體的脂質(zhì)特異性激活提供了理論框架 。 C aspase-4/11 CARD 如何在分子層面識別?；湶l(fā)生寡聚化，其精確機(jī)制仍有待闡明 ， 解決這些問題將需要對 caspase-4/11 CARD 與不同 LPS 物種形成的復(fù)合物開展高分辨率結(jié)構(gòu) 生物學(xué) 研究。

康涅狄格大學(xué)健康中心免疫系阮建彬教授為本文的通訊作者，汪成亮博士、 Philip Lacey 博士以及田甜博士為論文的共同第一作者，該系 Vijay A. Rathinam 教授 與俄亥俄州立大學(xué) Vicki H. Wysocki 教授及其課題組成員作為主要貢獻(xiàn)人參與了該課題研究。

康涅狄格大學(xué)健康中心阮建彬教授課題組招聘：阮建彬教授課題組一直圍繞天然免疫信號通路以及病原體引起的免疫應(yīng)答分子機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為相關(guān)感染性疾病譬如膿毒癥（ Sepsis ）、癌癥及自身免疫性疾病等探索新的藥物靶點(diǎn)，提供新的治療策略。阮建彬博士在天然免疫領(lǐng)域取得一系列原創(chuàng)性成果，發(fā)表高水平研究論文 4 0 余篇，其中以第一或者通訊作者在 Nature(4 篇 ) 、 Cell 、 Science Advance s 、 EMBO Journal 等雜志發(fā)表論文 等 10 余篇，以共同作者在 Nature 、 Science 、 Cell 、 Nature Immunology 等雜志發(fā)表論文 20 余篇，他引 >11,000 余次。 歡迎 有理想、有興趣的研究生或者博士 后 加入這支年輕、敢于挑戰(zhàn)的團(tuán)隊(duì)。

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adz4623

制版人： 十一

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