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哺乳動物細胞可廣泛應(yīng)用于重組蛋白、單克隆抗體以及疫苗等生物制品的生產(chǎn)。近年來生物藥市場需求量激增，特別是新冠疫情加深了對疫苗和抗體藥物的現(xiàn)實需求，高產(chǎn)量、高質(zhì)量、低成本的哺乳動物細胞灌流培養(yǎng)工藝順勢成為生物制品行業(yè)普遍關(guān)注的熱點。本文圍繞細胞培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)工藝（特別是灌流培養(yǎng)工藝）、微載體培養(yǎng)、籃式反應(yīng)器培養(yǎng)和全懸浮培養(yǎng)等展開論述，綜述了近年來在哺乳動物培養(yǎng)工藝開發(fā)和優(yōu)化上取得的進步和提出的策略，旨在為生物制品行業(yè)哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的開發(fā)提供參考。

▌背景

近年來生物藥占據(jù)的市場份額發(fā)展更為迅猛，僅單克隆抗體便占去2017年年度十大暢銷藥中的8個名額，且年度銷售額高達1230億美元。隨著近年來市場上對生物藥物需求量的持續(xù)增長，特別是新冠病毒疫情持續(xù)流行加強了生物藥物收益大幅度提升空間，更是在全球范圍內(nèi)掀起了哺乳動物細胞培養(yǎng)的熱潮。

目前用于工業(yè)化生產(chǎn)的哺乳動物細胞株主要有中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、倉鼠胚腎細胞(BHK)、小鼠骨髓瘤細胞(NS0和SP2/0)，還有一些人類細胞株，包括HEK293和HT-2080。其中對CHO細胞株的研究最為充分，應(yīng)用最為廣泛。2014年~2018年，約84%批準(zhǔn)的單抗藥來源于CHO細胞。值得注意的是，中國科學(xué)院微生物研究所和安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司聯(lián)合研發(fā)重組新型冠狀病毒疫苗也是采用的CHO細胞表達生產(chǎn)，該疫苗是首個獲批的國產(chǎn)重組新冠病毒蛋白疫苗。

圖1. CHO-K1株細胞（圖來源于ATCC，https://www.atcc.org/products/ccl-61）

維持細胞在體外正常的生長、增殖需要為其提供適宜的生長環(huán)境，其中培養(yǎng)基是細胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，而其他各種試劑，包括一些鹽平衡溶液、消化液、pH調(diào)整液等，對細胞培養(yǎng)體系的維持也必不可少。細胞培養(yǎng)基是動物細胞培養(yǎng)中不可缺少的部分，但是培養(yǎng)基的種類很多，對于不同的細胞類型及其研究目的，采用合適的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)才能起到很好的效果。哺乳動物細胞常見類型及培養(yǎng)基種類匯總見表1。

表1. 哺乳動物細胞常見類型及培養(yǎng)基種類

注：BME:Basal Medium Eagle；DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium；FBS: Fetal Bovine Serum；IMDM: Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；MEM: Minimum Essential Medium；NEAA: Non-Essential Amino Acids Solution.

▌哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝

哺乳動物細胞體外培養(yǎng)較之傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)難度較大，主要是由于哺乳動物細胞倍增時間長、代謝途徑復(fù)雜、對外界環(huán)境敏感性強、對營養(yǎng)要求苛刻，且培養(yǎng)過程中細胞狀態(tài)容易改變。目前常用的哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝有：批次培養(yǎng)、補料批次培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)，見圖1。

圖1. 目前常用哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝示意圖

（注：A批次培養(yǎng)工藝、B補料培養(yǎng)工藝、C灌流培養(yǎng)工藝,；圖：張瓊瓊等,2020）

與傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)相比，基于哺乳動物細胞灌流培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)物產(chǎn)量、質(zhì)量及成本等方面表現(xiàn)出來的顯著優(yōu)勢，見表2。灌流培養(yǎng)工藝存在的特有之處及工藝優(yōu)化應(yīng)著重關(guān)注的地方有：?灌流新鮮培養(yǎng)基，灌流速率的大小調(diào)節(jié)；?放流多余細胞，放流速率的大小調(diào)節(jié)；?灌流工藝培養(yǎng)周期較長，細胞活率的維持和產(chǎn)量的提高；?細胞截留裝置，細胞的高效截留和產(chǎn)物的高效濾過。

表2. 各種培養(yǎng)工藝比較

▌微載體培養(yǎng)

微載體是一種新興的大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)，是當(dāng)前貼壁依賴型細胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法。微載體以微小顆粒作為細胞貼附的載體，可提供相當(dāng)大的貼附面積，由于載體體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可使得細胞懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，最終能夠使細胞在載體表面繁殖成單層的一種細胞培養(yǎng)技術(shù)。具有均相培養(yǎng)兼具平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢、培養(yǎng)條件（溫度、ｐＨ、二氧化碳濃度等）容易控制并且培養(yǎng)過程系統(tǒng)化、自動化、不易被污染。

圖2. 細胞在微載體上培養(yǎng)生長情況

（圖有改動，來源于制藥業(yè)：https://pharm.vogel.com.cn/c/1178/1178363.shtml）

微載體工藝是一種目前已經(jīng)應(yīng)用相對成熟的貼壁細胞培養(yǎng)模式，可以讓貼壁細胞做到近似于懸浮培養(yǎng)，而微載體培養(yǎng)想要實現(xiàn)灌流工藝就必須結(jié)合ATF或Spin filter等截流裝置使用；而傳統(tǒng)的攪拌槳配合Spin filter的培養(yǎng)模式，雖然可以將載體與細胞截流在反應(yīng)器內(nèi)，但長時間培養(yǎng)攪拌槳產(chǎn)生的剪切力會影響細胞生長并產(chǎn)生碎片載體，且一旦載體投放量或細胞密度較大難免發(fā)生堵塞。

Eppendorf的Cell lift攪拌槳與傳統(tǒng)攪拌模式不同，其獨特的設(shè)計將氣泡與微載體及細胞進行隔離，并通過離心力和壓差的方式進行傳質(zhì)，確保微載體及細胞不受剪切力的影響。灌流時與Cell lift搭配使用的截流裝置—decanter可通過微載體與培養(yǎng)基的密度差進行載體細胞的截流。Cell lift與decanter 的搭配，整套裝置無需任何耗材，不僅可以實現(xiàn)最高25g/L的微載體投放量，同時可以最大程度的減小灌流的成本，見圖3。

圖3. Cell lift（提升式）攪拌槳（圖源Eppendorf）

▌籃式反應(yīng)器培養(yǎng)

籃式反應(yīng)器又稱固定床生物反應(yīng)器，通過固定床（內(nèi)有填充材料，聚酯切片disk載體，簡稱片狀載體）使培養(yǎng)基循環(huán)，細胞長在填充物的表面或內(nèi)部。液體循環(huán)過程中流經(jīng)床層，細胞被截留在載體中，其剪切力低，對細胞損傷小，通過分批或連續(xù)灌流的方式，可延長細胞培養(yǎng)的時間。

籃式反應(yīng)器與微載體反應(yīng)器之間最本質(zhì)的區(qū)別是支撐細胞貼壁生長的載體不同：微載體為葡聚糖實心球形，細胞僅能在表面生長，需依靠攪拌保持懸浮運動狀態(tài)，而攪拌帶來的剪切力會影響細胞的生長因此微載體反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速不宜過高。片狀載體（Fibra-Cel disk）是一種固體支持基質(zhì)，供哺乳動物及昆蟲細胞生長，主要用于分泌產(chǎn)物（如重組蛋白及病毒）。

然而，籃式反應(yīng)器的獨特設(shè)計帶來諸多優(yōu)勢的同時，也帶來了該類反應(yīng)器不能直接取樣觀察細胞狀態(tài)、細胞在線消化實現(xiàn)反應(yīng)器規(guī)模放大的局限和技術(shù)瓶頸，特別是，片狀載體是蜂窩狀的高密度生長體，如采用傳統(tǒng)消化方法，需持續(xù)40-50分鐘，大部分細胞因過度消化而死亡，細胞團聚，無法實現(xiàn)逐級在線放大。

圖4. 籃式反應(yīng)器（固定床生物反應(yīng)器）（圖源：Eppendorf）

Eppendorf 的籃式攪拌槳配合片狀載體使用，可將細胞捕獲在片狀載體組成的固定床上，攪拌槳與氣泡不會與細胞進行直接接觸，避免了剪切力的傷害；片狀載體可觀的比表面積為細胞生長提供了充足的生長空間，以Vero細胞為例細胞生長密度可高達40×106Cell/mL。由于細胞被捕獲于固定床上，在培養(yǎng)時可方便快速的進行去血清換液，也可以在沒有任何截流裝置的情況下進行灌流培養(yǎng)，見圖5。

圖5. 籃式攪拌槳和片狀載體（圖源：Eppendorf）

▌全懸浮培養(yǎng)

全懸浮培養(yǎng)是指細胞自由懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)生長增殖的一種發(fā)酵方法。目前該項技術(shù)發(fā)展較快，已逐漸趨向成熟，是當(dāng)前國際上生物制品生產(chǎn)的主流模式。此工藝優(yōu)點是操作便捷、產(chǎn)率高、易放大，懸浮細胞可以在反應(yīng)器中直接生產(chǎn)增殖，細胞自由生長、培養(yǎng)環(huán)境均一、取樣簡單、培養(yǎng)操作簡單可控、放大方便、污染率和成本低；缺點是技術(shù)較為復(fù)雜、產(chǎn)物回收量大、培養(yǎng)液利用率低。懸浮發(fā)酵工藝適于許多工程細胞，例如CHO、 HEK293、雜交瘤、SP2/0、NSO等。

當(dāng)前動物細胞大規(guī)模發(fā)酵工藝中的主流方向是攪拌式懸浮連續(xù)發(fā)酵工藝，特別是抗體等大規(guī)模蛋白表達。在工業(yè)化生產(chǎn)中，懸浮培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制比其他發(fā)酵系統(tǒng)更易理解和掌握。通常，一個好的細胞發(fā)酵平臺可適用于多種不同重組蛋白或抗體的大規(guī)模表達，選擇適宜的平臺技術(shù)可有效減少工藝研究過程的時間。貼壁細胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法是采用轉(zhuǎn)瓶、堆積床和懸浮微載體培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶和堆積床培養(yǎng)的放大生產(chǎn)受到很多的限制，而懸浮微載體培養(yǎng)是目前疫苗生產(chǎn)經(jīng)常采用的一種形式。非傳統(tǒng)的貼壁細胞培養(yǎng)選用氣升式細胞發(fā)酵系統(tǒng)、膜透析生物反應(yīng)器和填充床灌流培養(yǎng)等。

圖6. 攪拌氣升式生物反應(yīng)器示意圖（圖:席仁榮等,2008）

細胞全懸浮培養(yǎng)工藝由于工藝相對簡單且易放大，受到眾多制藥企業(yè)的青睞。為方便工藝開發(fā)人員的使用，例如Eppendorf可提供從0.3~40 L不同攪拌及通氣方式的一次性硬質(zhì)罐體，可完美銜接后續(xù)用于生產(chǎn)的更大規(guī)模的一次性反應(yīng)袋。而對于缺乏豐富放大經(jīng)驗的研究人員而言，怎樣進行放大或采取什么樣的策略進行放大，必然會成為一道難題，Eppendorf針對這一難點在反應(yīng)器中增添了“放大助手”軟件，可以幫助使用人員進行放大策略的選擇以及給出相關(guān)參考數(shù)值，見圖7。

圖7. BioFlo 320生物反應(yīng)器 + 放大助手軟件（圖源：Eppendorf）

BioFlo 320生物過程控制臺旨在提供一個通用平臺，以滿足生物技術(shù)和制藥科學(xué)各階段不斷變化的需求。占地面積極小并且功能齊全，可配合包括籃式攪拌槳、cell lift攪拌槳在內(nèi)的多種攪拌系統(tǒng)，適用于從微生物發(fā)酵到細胞培養(yǎng)，從縱向擴展到橫向擴展，或從批次到流加的生物過程。

▌總結(jié)

越來越多獲批上市的生物藥物使用灌流培養(yǎng)工藝、全懸浮培養(yǎng)進行生產(chǎn)?；诓溉閯游锛毎锓磻?yīng)器灌流培養(yǎng)單位工作體積高產(chǎn)量、高質(zhì)量、低成本的顯著優(yōu)勢，近年來隨著生物藥物市場的逐步擴大，工業(yè)界和學(xué)術(shù)界普遍關(guān)注灌流工藝的開發(fā)和優(yōu)化，F(xiàn)DA也極大地鼓勵生物藥物生產(chǎn)工藝由傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)轉(zhuǎn)型到灌流培養(yǎng)。業(yè)界內(nèi)如Eppendorf的Cell lift攪拌槳、籃式攪拌槳、片狀載體、BioFlo 320生物反應(yīng)器等在全懸浮培養(yǎng)或者灌流培養(yǎng)工藝應(yīng)用越來越受到生物制藥行業(yè)的青睞。

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關(guān)于Eppendorf

Eppendorf是一家領(lǐng)先的生命科學(xué)公司，專注于研發(fā)和銷售實驗室的液體處理、樣品處理和細胞處理的儀器、耗材和服務(wù)。主要產(chǎn)品包括移液器、自動移液系統(tǒng)、分液器、離心機、混勻儀、分光光度計和DNA擴增儀，以及超低溫冰箱、發(fā)酵罐、生物反應(yīng)器、CO2 培養(yǎng)箱、生物搖床和細胞顯微操作系統(tǒng)，耗材類包括如移液吸頭、離心管、PCR板、微孔板和一次性生物反應(yīng)器罐體等高性能的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。

Eppendorf的產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于科研和商業(yè)性研發(fā)實驗室，例如制藥和生物技術(shù)、化學(xué)以及食品等行業(yè)。此外，我們的產(chǎn)品也被臨床和環(huán)境分析實驗室、法醫(yī)和工業(yè)類用戶在工藝分析、生產(chǎn)和質(zhì)量檢測等環(huán)節(jié)廣泛使用。

Eppendorf公司成立于1945年，總部位于德國漢堡，目前在全球有約4500名員工。我們在28個國家設(shè)有子公司，并在全球相關(guān)重要市場區(qū)域設(shè)有分銷商。

Eppendorf官網(wǎng)鏈接： https://www.eppendorf.cn

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