外泌體作為天然的細胞間信號載體，在腫瘤診斷、治療監(jiān)測中具有獨特優(yōu)勢。外泌體熒光標記可用于在體外或體內(nèi)追蹤外泌體的去向、攝取、分布和功能。常用的外泌體熒光標記染料主要分為兩大類，一類是結(jié)合到細胞膜脂質(zhì)區(qū)域上的脂溶性染料；另一類是能夠完全嵌入目標膜的脂質(zhì)雙層并跨膜的水溶性共軛寡電解質(zhì)（Conjugated Oligoelectrolytes，COEs） 。

COEs這種材料不僅具備優(yōu)異的光學穩(wěn)定性，能有效抵抗活體環(huán)境中的光漂白與代謝降解，還擁有良好的水溶性與生物相容性，可避免對細胞產(chǎn)生毒性影響；同時，其分子結(jié)構(gòu)可靈活調(diào)控，能通過特異性相互作用與外泌體穩(wěn)定結(jié)合，顯著提升標記效率并降低背景信號干擾。

一篇發(fā)表在 Advanced Materials 的文章中，研究人員就利用這種熒光材料 NIR-II COE（命名為 COE-BBT），用于小鼠腫瘤進展的長期追蹤。與傳統(tǒng)的外源性示蹤劑相比，COE-BBT 的 NIR-II（近紅外二區(qū)）發(fā)射會隨著腫瘤的生長而逐漸增加，成功實現(xiàn)小鼠腫瘤 14 天無毒性追蹤及微環(huán)境動態(tài)監(jiān)測。

這些結(jié)果證明了 COE 作為生物相容性非侵入性熒光探針的潛力，可用于體內(nèi)長期監(jiān)測生物過程。通過將外泌體與 COEs 精準結(jié)合，可構(gòu)建出高效標記、長期示蹤、精準定位的追蹤體系。

宇玫博深耕外泌體領(lǐng)域，專注提供外泌體提純及熒光染料相關(guān)解決方案。基于水溶性共軛寡電解質(zhì)（COEs）的熒光標記染料 Aco-490，Aco-600，標記效率與示蹤效果優(yōu)異，已被數(shù)十篇領(lǐng)域內(nèi)權(quán)威期刊如《Journal of Extracellular Vesicles》、《Theranostics》等引用，成為外泌體研究優(yōu)選工具，適配各類外泌體熒光追蹤場景。

為了進一步驗證這款染料的性能，我們使用 Aco600 染料（Umibio UR52423）對外泌體進行標記，與受體細胞共孵育，通過激光共聚焦顯微鏡觀察外泌體被靶細胞的攝取情況。以下是實驗流程，操作步驟可供您的實驗進行參考。

1. 外泌體熒光標記并去除游離染料

1.1. 用 PBS 將提取的外泌體濃度調(diào)整到約 1 × 1011 Particles /mL

1.2. 配制染色孵育體系

1.3. 去除游離染料

●染色完成后，于生物安全柜中加入 600 μL PBS在樣品里，使用 100 KDa 超濾管，以 3,000 ×g 的離心力離心 5～10 min，進行超濾置換，去除溶液中游離的染料，將上室樣品濃縮至原體積

●重復置換 2 次

●收集超濾管上室的樣本,送檢 NTA（50 μL）、BCA（50 μL）

2. 細胞共孵育

2.1. 提前 24 h 鋪 24 孔板（先放置細胞爬片)，將細胞懸液濃度調(diào)整為適當濃度，每孔加入 300 μL 細胞懸液，約 2 × 104 個細胞

2.2. 避光操作：用無血清培養(yǎng)基將染色樣本 EVs 濃度調(diào)整為適當濃度

2.3. 吸除待處理細胞原有的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗兩次

2.4. 避光操作：加入 300 μL 含染色 EVs 的新鮮培養(yǎng)基，染色 EVs 的粒子數(shù)約為 1 × 1010 個/孔，在細胞培養(yǎng)箱避光孵育 24 h

3. 細胞染色

3.1. DIO 細胞膜染色

● 孵育 24 小時后，棄去孵育液，用 PBS 清洗細胞 3 次

● 配制所需染色工作液體積

● 加入 300 μL 染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞

● 37℃ 避光孵育細胞 8 min

● 吸除細胞膜染色工作液，或 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min

● 使用 4% 多聚甲醛在室溫下固定 10 min 后觀察細胞形態(tài)

● 棄去 4% 多聚甲醛，用 PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 min

● 取出細胞爬片，用含 DAPI 封片劑進行封片

● 激共聚焦拍照

3.2. 細胞骨架染色

● 孵育 24 小時后，棄去孵育液，用 PBS 清洗細胞 3 次

● 使用 4% 多聚甲醛在室溫下固定 15 min 后觀察細胞形態(tài)

● 棄去 4% 多聚甲醛，用 PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 min

●（不透化）加入 0.1% Triton X-100 透化 5 min 后用 PBS 清洗細胞 3 次

● 配所需染色工作液體積

● 加入 300 μL 染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞

● 37 避光孵育細胞 30 min

● 吸除染色工作液，再用 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min

● 取出細胞爬片，用含 DAPI 封片劑進行封片

● 激共聚焦拍照

我們發(fā)現(xiàn)，外泌體與 MCF 細胞共孵育 24 h 后，在激光共聚焦拍攝下結(jié)果呈現(xiàn)令人滿意（細胞骨架染和細胞膜染）。

實驗分組：Aco600：僅染料組；EVs：僅外泌體組；Aco600+ EVs ：外泌體染色組。

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內(nèi)容策劃：王丹琦

內(nèi)容審核：吳軍

題圖來源：圖蟲創(chuàng)意

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參考文獻

[1] Zhou C, Li Z, Zhu Z, Chia GWN, Mikhailovsky A, Vázquez RJ, Chan SJW, Li K, Liu B, Bazan GC. Conjugated Oligoelectrolytes for Long-Term Tumor Tracking with Incremental NIR-II Emission. Adv Mater. 2022 May;34(20):e2201989. doi: 10.1002/adma.202201989. Epub 2022 Apr 18. PMID: 35306702.

[2] Zhou C, Cox-Vázquez SJ, Chia GWN, Vázquez RJ, Lai HY, Chan SJW, Limwongyut J, Bazan GC. Water-soluble extracellular vesicle probes based on conjugated oligoelectrolytes. Sci Adv. 2023 Jan 13;9(2):eade2996. doi: 10.1126/sciadv.ade2996. Epub 2023 Jan 11. PMID: 36630497; PMCID: PMC9833659.