外泌體作為天然的細胞間信號載體，在腫瘤診斷、治療監(jiān)測中具有獨特優(yōu)勢。外泌體熒光標記可用于在體外或體內追蹤外泌體的去向、攝取、分布和功能。常用的外泌體熒光標記染料主要分為兩大類，一類是結合到細胞膜脂質區(qū)域上的脂溶性染料；另一類是能夠完全嵌入目標膜的脂質雙層并跨膜的水溶性共軛寡電解質（Conjugated Oligoelectrolytes，COEs） 。

COEs這種材料不僅具備優(yōu)異的光學穩(wěn)定性，能有效抵抗活體環(huán)境中的光漂白與代謝降解，還擁有良好的水溶性與生物相容性，可避免對細胞產生毒性影響；同時，其分子結構可靈活調控，能通過特異性相互作用與外泌體穩(wěn)定結合，顯著提升標記效率并降低背景信號干擾。

一篇發(fā)表在 Advanced Materials 的文章中，研究人員就利用這種熒光材料 NIR-II COE（命名為 COE-BBT），用于小鼠腫瘤進展的長期追蹤。與傳統(tǒng)的外源性示蹤劑相比，COE-BBT 的 NIR-II（近紅外二區(qū)）發(fā)射會隨著腫瘤的生長而逐漸增加，成功實現(xiàn)小鼠腫瘤 14 天無毒性追蹤及微環(huán)境動態(tài)監(jiān)測。

這些結果證明了 COE 作為生物相容性非侵入性熒光探針的潛力，可用于體內長期監(jiān)測生物過程。通過將外泌體與 COEs 精準結合，可構建出高效標記、長期示蹤、精準定位的追蹤體系。

宇玫博深耕外泌體領域，專注提供外泌體提純及熒光染料相關解決方案。基于水溶性共軛寡電解質（COEs）的熒光標記染料 Aco-490，Aco-600，標記效率與示蹤效果優(yōu)異，已被數(shù)十篇領域內權威期刊如《Journal of Extracellular Vesicles》、《Theranostics》等引用，成為外泌體研究優(yōu)選工具，適配各類外泌體熒光追蹤場景。

為了進一步驗證這款染料的性能，我們使用 Aco600 染料（Umibio UR52423）對外泌體進行標記，與受體細胞共孵育，通過激光共聚焦顯微鏡觀察外泌體被靶細胞的攝取情況。以下是實驗流程，操作步驟可供您的實驗進行參考。

1. 外泌體熒光標記并去除游離染料

1.1. 用 PBS 將提取的外泌體濃度調整到約 1 × 1011 Particles /mL

1.2. 配制染色孵育體系

1.3. 去除游離染料

●染色完成后，于生物安全柜中加入 600 μL PBS在樣品里，使用 100 KDa 超濾管，以 3,000 ×g 的離心力離心 5～10 min，進行超濾置換，去除溶液中游離的染料，將上室樣品濃縮至原體積

●重復置換 2 次

●收集超濾管上室的樣本,送檢 NTA（50 μL）、BCA（50 μL）

2. 細胞共孵育

2.1. 提前 24 h 鋪 24 孔板（先放置細胞爬片)，將細胞懸液濃度調整為適當濃度，每孔加入 300 μL 細胞懸液，約 2 × 104 個細胞

2.2. 避光操作：用無血清培養(yǎng)基將染色樣本 EVs 濃度調整為適當濃度

2.3. 吸除待處理細胞原有的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗兩次

2.4. 避光操作：加入 300 μL 含染色 EVs 的新鮮培養(yǎng)基，染色 EVs 的粒子數(shù)約為 1 × 1010 個/孔，在細胞培養(yǎng)箱避光孵育 24 h

3. 細胞染色

3.1. DIO 細胞膜染色

● 孵育 24 小時后，棄去孵育液，用 PBS 清洗細胞 3 次

● 配制所需染色工作液體積

● 加入 300 μL 染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞

● 37℃ 避光孵育細胞 8 min

● 吸除細胞膜染色工作液，或 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min

● 使用 4% 多聚甲醛在室溫下固定 10 min 后觀察細胞形態(tài)

● 棄去 4% 多聚甲醛，用 PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 min

● 取出細胞爬片，用含 DAPI 封片劑進行封片

● 激共聚焦拍照

3.2. 細胞骨架染色

● 孵育 24 小時后，棄去孵育液，用 PBS 清洗細胞 3 次

● 使用 4% 多聚甲醛在室溫下固定 15 min 后觀察細胞形態(tài)

● 棄去 4% 多聚甲醛，用 PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 min

●（不透化）加入 0.1% Triton X-100 透化 5 min 后用 PBS 清洗細胞 3 次

● 配所需染色工作液體積

● 加入 300 μL 染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞

● 37 避光孵育細胞 30 min

● 吸除染色工作液，再用 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min

● 取出細胞爬片，用含 DAPI 封片劑進行封片

● 激共聚焦拍照

我們發(fā)現(xiàn)，外泌體與 MCF 細胞共孵育 24 h 后，在激光共聚焦拍攝下結果呈現(xiàn)令人滿意（細胞骨架染和細胞膜染）。

實驗分組：Aco600：僅染料組；EVs：僅外泌體組；Aco600+ EVs ：外泌體染色組。

宇玫博生物聚焦外泌體研究全鏈條需求，同步提供覆蓋提取、純化、檢測、培養(yǎng)等多環(huán)節(jié)的試劑盒產品與技術支持。有針對血清/血漿、細胞上清、尿液等不同生物樣本的外泌體提取純化試劑盒；適配植物樣本的專屬試劑盒，涵蓋干品、粘稠汁液、多汁植物等不同類型的植物囊泡提取純化試劑盒；還有外泌體檢測專用試劑，如 CD81、CD63 & TSG101 蛋白檢測試劑盒，以及水溶性熒光標記染料等輔助試劑，同時提供去外泌體胎牛血清、專用細胞培養(yǎng)基等配套產品�，F(xiàn)有兩款產品開啟免費試用，點擊下方圖片即可領取，無需回收。

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內容策劃：王丹琦

內容審核：吳軍

題圖來源：圖蟲創(chuàng)意

文中圖片均來源于宇玫博，未經允許不得取用

參考文獻

[1] Zhou C, Li Z, Zhu Z, Chia GWN, Mikhailovsky A, Vázquez RJ, Chan SJW, Li K, Liu B, Bazan GC. Conjugated Oligoelectrolytes for Long-Term Tumor Tracking with Incremental NIR-II Emission. Adv Mater. 2022 May;34(20):e2201989. doi: 10.1002/adma.202201989. Epub 2022 Apr 18. PMID: 35306702.

[2] Zhou C, Cox-Vázquez SJ, Chia GWN, Vázquez RJ, Lai HY, Chan SJW, Limwongyut J, Bazan GC. Water-soluble extracellular vesicle probes based on conjugated oligoelectrolytes. Sci Adv. 2023 Jan 13;9(2):eade2996. doi: 10.1126/sciadv.ade2996. Epub 2023 Jan 11. PMID: 36630497; PMCID: PMC9833659.