是有機(jī)合成中最常用的分離純化手段，大公司合成實(shí)驗(yàn)室一般都配備自動(dòng)化程度比較高的分離純化工具---快速制備色譜儀(中低壓制備色譜)，在醫(yī)藥外包公司俗稱過柱機(jī)。由名字可知，這就是個(gè)替代手工過柱的工具，他所用到的柱子我們常叫它Flash柱。除了可以用來過硅膠正相柱，還可以過乙腈(甲醇）/水體系的C18填料的反相柱，反相柱一定程度上可以替代制備高效液相色譜，特別是大量樣品分離時(shí)，可以節(jié)省大量成本。

往期文章: 【】中已經(jīng)詳細(xì)介紹了濕法上樣和干法上樣，文章中主要是介紹了硅膠柱柱層析技術(shù)，因此用過柱機(jī)過正相硅膠柱時(shí)情況類似。

反相柱層析最常用的填料是C18反相硅膠填料，這類反相硅膠是利用C18烷基硅烷將硅膠的-SiOH基團(tuán)封住，形成了很多C18鍵合微孔，對(duì)于小極性的化合物吸附能強(qiáng)，相反對(duì)大極性的化合物的吸附能力弱，因此和正相硅膠的洗脫順序相反，因此稱為反相硅膠。

我們?cè)谶M(jìn)行反相柱層析時(shí)，梯度洗脫開始以大比例極性水溶液開始，由于C18反相硅膠填料表面疏水性，疏水官能團(tuán)就會(huì)發(fā)生蜷縮，因此使用前需要用極性有機(jī)溶劑活化（疏水官能團(tuán)得以舒展），再過渡到水溶劑（保持其吸附活性）?；罨胶獾牟襟E必不可少，否則會(huì)明顯影響分離效率。

對(duì)于 乙腈(甲醇）/水體系的C18填料的反相柱 ，濕法上樣是應(yīng)用最廣泛，使用最簡(jiǎn)單的上樣技術(shù)。如果是固體樣品，只需將樣品直接溶解在盡量少的溶劑中，然后注入色譜柱中即可完成上樣，而如果是液體樣品，其上樣方式則會(huì)更簡(jiǎn)單，直接將樣品注入色譜柱即可。但是濕法上樣有一些缺點(diǎn)：1、當(dāng)上樣體積增大時(shí)，樣品在色譜柱當(dāng)中所占用的體積會(huì)增大，擴(kuò)散效應(yīng)也會(huì)明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致色帶變寬，降低分離效率，純度也隨之降低；2、請(qǐng)盡量使用大極性的溶劑溶解樣品，如果極性過小，樣品還沒有來得及和固定相相互作用，就已經(jīng)被極性溶劑洗脫下色譜柱，導(dǎo)致保留時(shí)間不夠，洗脫不充分，分離效率大大降低。特別是極性特別大的樣品，濕法上樣后很容易直接把樣品沖出，沒有分離效果。

C18反相柱能否像正相硅膠柱一樣，拌樣后，進(jìn)行干法上樣呢？

小編親試，完全可以進(jìn)行干法上樣，唯一的缺點(diǎn)就是C18填料有點(diǎn)貴，但是拌樣后的C18填料可以沖洗干凈后可以重復(fù)利用。與硅膠柱的拌樣類似，先用沸點(diǎn)較低溶劑溶解樣品，加入C18硅膠后，旋干，然后將干粉轉(zhuǎn)移到空柱子中，填料上方加上篩板或脫脂棉都可以，旋緊，將上樣柱接在反相柱上直接過柱就可以了（建議先將反相柱平衡好，接上上樣柱后直接運(yùn)行梯度）。

反相柱干法上樣相比濕法有以下優(yōu)點(diǎn)：一、干法上樣峰型變窄，分離效果明顯提高。二、另外對(duì)于一些溶解度較差的樣品，如果利用濕法上樣，需要用大量的溶劑溶解，因此上樣量受到限制，如果一次上太多，分離效果很差，但干法上樣克服了此缺點(diǎn)。三、還有一些樣品濕法上樣注入反相柱后，直接從水相比例較高的梯度開始沖柱時(shí)，產(chǎn)品會(huì)迅速析出，導(dǎo)致柱子堵住，干法上樣則很少堵柱。四、對(duì)于大極性的化合物（LCMS保留時(shí)間在0.5min以內(nèi)的化合物），濕法上樣，有時(shí)直接用水相就可以將化合物沖出，用干法上樣則可以明顯提高柱效以及分離樣品純度。五、上文中提到C18反相硅膠中有很多C18鏈硅氧鍵，因此強(qiáng)酸體系不能直接拌樣，否則硅氧鍵斷裂，C18硅膠失效，會(huì)明顯影響分離效果。