衰老是人體各器官的總體機(jī)能隨時間推移逐漸降低的過程，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜且具有多層級性，其根源在于各種分子和細(xì)胞損傷的漸續(xù)累積。研究發(fā)現(xiàn)，衰老和慢性病的產(chǎn)生均與過度氧化引起的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等不同程度損傷密切相關(guān)。

通常細(xì)胞處于氧化還原動態(tài)平衡狀態(tài)，多種抗氧化酶和食物源的有益因子在其中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。減少細(xì)胞過氧化、抑制DNA損傷是促進(jìn)居民健康的重要策略。我國居民日常膳食原材料中，稻米品質(zhì)升級對居民營養(yǎng)和健康具有重要意義。有色稻種有益蛋白質(zhì)、多酚類抗氧化成分等相對普通稻米具有顯著優(yōu)勢，這些有益成分被人體消化吸收，或進(jìn)一步參與體內(nèi)脂質(zhì)、血糖、氧自由基等代謝調(diào)控，從而在抑制動脈硬化、腫瘤等慢性病發(fā)生、促進(jìn)居民健康等方面發(fā)揮功效。

湖北民族大學(xué)生物與食品工程學(xué)院汪海洋、趙玉楠、方慶*等篩選紅米稻中過氧化還原酶編碼基因，針對大紅谷

OsPrx3

01

紅米稻OsPrx3蛋白的原核表達(dá)

抗氧化酶系對維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原相對平衡能夠發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Prxs是抗氧化酶系中的典型基因家族之一，因其多功能性備受關(guān)注?；诠δ茏⑨?，從亞洲栽培紅米稻基因組中篩選出編碼Prxs的基因。其中OsPrx3全長CDS為489 bp，為實(shí)現(xiàn)目的基因OsPrx3高量表達(dá)，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增后，借助限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和EcoR I消化產(chǎn)生黏性末端，再經(jīng)分子重組使OsPrx3全長CDS載入pCold I載體冷休克基因cspA啟動子（cspA Pro.）下游，成功構(gòu)建目的基因全長CDS融合His-tag的表達(dá)載體pColdI-cspA Pro:OsPrx3（圖1A）。

將對照空載體pCold I及測序正確的重組載體分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21細(xì)胞，16 ℃低溫附加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，分別收集菌體超聲裂解后進(jìn)行SDS-PAGE。如圖1B所示，對照菌（emVec/Bl）的各個樣品中均無對應(yīng)蛋白聚集（泳道1～6）。而重組菌（reVec/Bl）在無論是否有IPTG誘導(dǎo)劑添加的情況下，在全菌樣（泳道7、10）、上清樣（泳道9、12）和沉淀樣（泳道8、11）中均出現(xiàn)目標(biāo)蛋白。OsPrx3的分子質(zhì)量約為24 kDa。比較而言，在0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下，重組菌中生成的目的蛋白量更多（泳道10）；沉淀樣中亦出現(xiàn)相應(yīng)蛋白，很可能是目的蛋白的包涵體，但較上清樣中略少。以上結(jié)果表明，在此實(shí)驗(yàn)條件下可實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高量表達(dá)和分離。

OsPrx3僅有一個半胱氨酸，第51位半胱氨酸很可能是支持其酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。分子結(jié)構(gòu)模擬顯示OsPrx3含多個二級結(jié)構(gòu)如折疊和螺旋。總體來看，其“類口袋”的分子構(gòu)型及第51位半胱氨酸處于“口袋”底端，為其對底物或靶標(biāo)的作用提供了空間（圖1C）。

02

OsPrx3的羥自由基清除活性及其關(guān)鍵位點(diǎn)分析

羥自由基是造成氧化損傷的強(qiáng)自由基類型。以純化的OsPrx3蛋白探究其羥自由基清除活性。如圖2所示，在0.5 mg/mL條件下，OsPrx3對羥自由基清除率雖遠(yuǎn)低于VC，但仍達(dá)到30%以上；隨著質(zhì)量濃度的增加，OsPrx3的羥自由基清除率也顯著提升，在1.0 mg/mL和2.0 mg/mL條件下，OsPrx3的羥自由基清除率分別可達(dá)40%和80%。

陰性對照BSA的羥自由基清除率為零。而OsPrx3突變體OsPrx3mC51A的羥自由基清除率幾乎接近零，與陰性對照BSA無顯著差異?？梢?，大腸桿菌表達(dá)OsPrx3蛋白體外對羥自由基具有相對較強(qiáng)的清除活性，而第51位半胱氨酸為其關(guān)鍵位點(diǎn)。

03

OsPrx3對DNA氧化損傷的抑制作用

人體衰老和慢性病的發(fā)生與細(xì)胞過度氧化及DNA氧化損傷密切相關(guān)。為證實(shí)OsPrx3體外抑制DNA氧化損傷的功能，進(jìn)行DNA缺刻實(shí)驗(yàn)。在DTT/Fe3＋/O2反應(yīng)溶液中，羥自由基生成后作用于質(zhì)粒DNA，其鏈斷裂由SF變成NF，兩類DNA分子因構(gòu)象不同而在瓊脂糖凝膠電泳時遷移率產(chǎn)生明顯差異。

如圖3所示，體系中無羥自由基產(chǎn)生時，閉合環(huán)狀超螺旋的pMD18質(zhì)粒DNA（泳道1、2、5、6），即SFDNA遷移率未明顯變化，表明此時的DNA構(gòu)象與含量未有改變。當(dāng)有羥自由基產(chǎn)生時，DNA缺刻明顯，NFDNA遷移明顯滯后（泳道3和7）；僅有BSA添加的情況下DNA的缺刻狀態(tài)明顯（泳道3）；而在OsPrx3作用下，NF-DNA較之BSA添加條件下明顯減少（泳道4）。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建缺刻實(shí)驗(yàn)體系，以pMD18進(jìn)行反應(yīng)效果較好，也初步顯示OsPrx3具有抑制DNA氧化損傷的功能。

04

OsPrx3作用的濃度效應(yīng)

為探明OsPrx3抑制DNA氧化損傷的濃度與效率關(guān)系，設(shè)計(jì)OsPrx3濃度梯度實(shí)驗(yàn)。以SF-DNA在pMD18中的相對含量為OsPrx3抑制效率的參考標(biāo)準(zhǔn)。在50 μL反應(yīng)體系中加入3 μg pMD18質(zhì)粒于37 ℃反應(yīng)2 h后，OsPrx3抑制DNA氧化損傷結(jié)果如圖4所示。在0.06～0.18 μg/μL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OsPrx3對體系中pMD18氧化損傷抑制作用逐漸增強(qiáng)，SF-DNA相對含量逐漸從52.9%增加至最高（88.9%）（圖4A、B），在酶質(zhì)量濃度增加2 倍的條件下OsPrx3抑制效率提高了68.1%。隨著OsPrx3質(zhì)量濃度繼續(xù)增加（0.21～0.30 μg/μL），SF-DNA相對含量分別為70.5%、85.0%和83.0%，雖都維持在70.0%以上，但均低于0.18 μg/μL時的抑制效應(yīng)（圖4B）?？傮w上，當(dāng)OsPrx3由0.06 μg/μL增至0.18 μg/μL，其對pMD18氧化損傷的抑制效率可增加至原來的1.7 倍。而當(dāng)OsPrx3質(zhì)量濃度最高（0.30 μg/μL）時，并未產(chǎn)生相應(yīng)最高損傷抑制效應(yīng)。在上述較低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.06～0.18 μg/μL），OsPrx3的使用濃度與抑制DNA氧化損傷的效果之間具有較為明顯的量效關(guān)系。

SF-DNA與NF-DNA含量比例（SF/NF值）能夠更直觀反映OsPrx3發(fā)揮的抑制作用。當(dāng)OsPrx3質(zhì)量濃度為0.18 μg/μL時對應(yīng)最高的SF/NF值；當(dāng)OsPrx3質(zhì)量濃度為0.15 μg/μL時SF/NF值高于0.21 μg/μL時對應(yīng)的SF/NF值（圖4C）。上述4 個較低的質(zhì)量濃度梯度下，OsPrx3對體系中pMD18氧化損傷抑制效率均值為72.8%。而當(dāng)OsPrx3質(zhì)量濃度為0.15 μg/μL時，其實(shí)際抑制效率達(dá)77.5%。OsPrx3因具有Cys，其中的S-OH作用體系中羥自由基，能夠發(fā)揮底物DNA損傷抑制作用。根據(jù)“高效-節(jié)約”原則，對于3 μg底物pMD18，推測OsPrx3在上述反應(yīng)體系中的最適反應(yīng)質(zhì)量濃度為0.15 μg/μL。

05

OsPrx3對DNA氧化損傷的即時作用

為了探明OsPrx3在最適質(zhì)量濃度條件下（0.15 μg/μL）抑制DNA氧化損傷的時效性，進(jìn)行時間梯度實(shí)驗(yàn)。如圖5A、C所示，對照BSA添加條件下，隨反應(yīng)時間延長，pMD18中SF-DNA相對含量明顯降低，由初始15 min的61.7%降至180 min的25.3%。

而在OsPrx3作用下，SF-DNA從30 min時才開始明顯減少，至180 min時SF-DNA相對含量才降至60.4%；若僅以O(shè)sPrx3作用下SF-DNA開始減少為起點(diǎn)，則OsPrx3完全抑制DNA氧化損傷時間可達(dá)30 min；設(shè)定SF/NF值達(dá)1.0為體系氧化還原平衡點(diǎn)，若以SF-DNA相對含量開始低于NF-DNA相對含量視為抑制效應(yīng)解除，即兩者比例不低于氧化還原平衡值1.0時，則OsPrx3對DNA氧化損傷抑制作用至少可維持180 min（OsPrx3作用180 min的SF-DNA相對含量為60.4%，高于相應(yīng)體系中NF-DNA的相對含量（39.6%），此時SF/NF值為1.5）（圖5B、C）。

總體上，隨時間延長原pMD18的氧化損傷均逐漸加重，但OsPrx3對體系中的原pMD18質(zhì)粒DNA氧化損傷抑制作用更為突出。構(gòu)建以BSA為參照的OsPrx3抑制DNA氧化損傷時間-相對含量曲線模型，OsPrx3與BSA在各個相同時點(diǎn)的作用效果差異明顯（圖5C）。

06

OsPrx3的作用模型分析

為更好理解OsPrx3的功能及其潛在調(diào)控方式，構(gòu)建其工作模型。如圖6所示，OsPrx3以其分子內(nèi)過氧化活性位點(diǎn)-半胱氨酸殘基上的巰基抵抗過氧化，發(fā)揮DNA氧化損傷抑制作用。其可及時抑制羥自由基等活性氧的損傷作用，使得體外多數(shù)DNA得到防護(hù)；脫離抑制的自由基等可能造成DNA損傷。汪海洋等研究發(fā)現(xiàn)OsPrx3可顯著抑制線蟲體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，增強(qiáng)線蟲抵御氧化的能力。若OsPrx3蛋白質(zhì)被攝入，可經(jīng)消化轉(zhuǎn)為不同肽段，再吸收進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮其他調(diào)控功能；或轉(zhuǎn)變?yōu)闈撛诨钚噪亩?，進(jìn)一步發(fā)揮有益作用?；诖耍暨M(jìn)一步開發(fā)其功能，可促進(jìn)稻米品質(zhì)升級或提高其促健康作用。

討論與結(jié)論

紅米稻屬于典型的有色稻，在我國栽培歷史悠久、地域適應(yīng)性廣闊。紅米稻增益健康成分如氨基酸、蛋白質(zhì)等優(yōu)于普通稻米，在我國居民日常膳食中具有重要地位。目前，紅米稻遺傳資源及其中潛在重要功能因子尚待深入發(fā)掘。本研究進(jìn)一步證實(shí)，大紅谷中Prxs基因OsPrx3原核細(xì)胞表達(dá)的蛋白在體外具有較強(qiáng)抑制DNA氧化損傷的功能。OsPrx3的羥自由基清除率最高可達(dá)80%（圖2）；在質(zhì)量濃度為0.15 μg/μL條件下，OsPrx3對體外質(zhì)粒DNA氧化損傷抑制率均值可達(dá)75%以上，顯著高于對照BSA（圖4A、B）。

根據(jù)序列中是否含有第2個半胱氨酸殘基，Prxs基因家族可分為典型2-Cys Prx、非典型2-Cys Prx和1-Cys Prx亞家族。OsPrx3氨基酸序列中僅含第51位過氧化半胱氨酸，應(yīng)屬于Prxs家族中的1-Cys亞族。通過構(gòu)建定點(diǎn)突變體OsPrx3mC51A，證實(shí)第51位Cys是OsPrx3分子活性的關(guān)鍵位點(diǎn)（圖2）。1-Cys亞族Prx氧化后形成二硫鍵，可通過電子供體還原以恢復(fù)其過氧化還原活性。體外OsPrx3應(yīng)依賴其第51位Cys中S—OH較強(qiáng)的還原活性，消除反應(yīng)體系自由基對SF-DNA鏈上核苷酸磷酸鍵的破壞，從而發(fā)揮抑制DNA氧化損傷的作用。因此，該酶對DNA氧化損傷的抑制效應(yīng)主要源于其對羥自由基等的消除作用。本研究發(fā)現(xiàn)OsPrx3的DNA氧化損傷抑制率最高可達(dá)88.9%；而最適作用濃度下，其維系相對較高的抑制效應(yīng)可達(dá)180 min之久，而且在前30 min的抑制水平相對最高，表明其活性在該條件下具有較好的穩(wěn)定性與高效率（圖5），也預(yù)示其可能具有重要應(yīng)用潛能。

DNA氧化損傷以及修復(fù)缺陷可能是衰老和復(fù)雜慢性病產(chǎn)生的重要因素。慢性病通常具有起病隱匿、病因復(fù)雜、病程長且遷延難愈的特點(diǎn)；而身體衰老的同時會極大增加慢性病發(fā)生概率。目前老齡人口逐年急劇增加，構(gòu)成慢性病患者的主要群體。總體來看由慢性病帶來的諸多危害仍十分突出，常見的慢性病如心腦血管疾病、癌癥、糖尿病對老齡人口健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。面向未來深入開發(fā)主要作物中的促健康、抗衰老因子，積極探索和推進(jìn)作物品質(zhì)升級保障“增進(jìn)健康、延緩衰老”總目標(biāo)達(dá)成，是響應(yīng)“健康老齡化”的重大策略。諸多研究表明，Prxs基因家族在細(xì)胞維持氧化還原狀態(tài)平衡、抑制氧化損傷等方面發(fā)揮重要功能。例如，細(xì)胞內(nèi)Prx1在端粒染色質(zhì)中富集，這與活性氧誘導(dǎo)的端粒損傷相反；而氧化損傷后，基因敲除突變體細(xì)胞中端粒單鏈DNA斷裂增多，導(dǎo)致端粒迅速縮短。另有研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中Prx II缺失，會顯著加速細(xì)胞衰老。以上研究表明Prxs基因家族能夠參與衰老調(diào)控。

研究人類及其他哺乳動物中的Prxs，進(jìn)一步證實(shí)該家族基因的多功能性及應(yīng)用潛力。例如，重組人過氧化物還原酶-5的表達(dá)產(chǎn)物可不直接殺傷目標(biāo)細(xì)胞，卻能夠激活機(jī)體正常的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而控制與清除腫瘤；而鼠源重組過氧化物還原酶-5對小鼠具有顯著的抗胰腺癌活性。對過氧化物酶3在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)模型進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)其可能亦參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Yin Wen等發(fā)現(xiàn)棕櫚酸會抑制小鼠Prx1的活性，由此加重雄性小鼠非酒精性脂肪性肝炎；而研究表明，Prx1在多種人類腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)特征；另外，值得注意的是Prx1的表達(dá)可能受到核因子-E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2）調(diào)控。當(dāng)Nrf2被敲除后，細(xì)胞無論是在穩(wěn)態(tài)或缺氧/復(fù)氧應(yīng)激條件下，Prx1基因表達(dá)均出現(xiàn)顯著下調(diào)；蛋白質(zhì)-核酸互作實(shí)驗(yàn)證據(jù)亦顯示在缺氧/復(fù)氧應(yīng)激條件下Prx1啟動子區(qū)及其上游順式元件易被Nrf2蛋白結(jié)合。以上研究顯示出Prxs作為相關(guān)腫瘤治療靶向的可能性。

近年來，伴隨基因組學(xué)等科學(xué)研究方法進(jìn)步，植物中的Prx基因家族亦被發(fā)現(xiàn)具有重要調(diào)控功能。Zang Dongtian等研究證實(shí)普通小麥的Prx基因（TaPRX-2A）能夠負(fù)調(diào)控麥穗粒數(shù)量，過表達(dá)目的基因使麥穗粒數(shù)比正常小麥明顯減少。汪海洋等發(fā)現(xiàn)OsPrx3蛋白可影響線蟲氧化應(yīng)激耐受及壽命調(diào)控基因的表達(dá)，如SKN-1在飼喂目的蛋白的線蟲體內(nèi)顯著上調(diào)表達(dá)。該研究也表明OsPrx3對受試動物具有有益作用，其若被動物攝入、消化為潛在功能肽段，能夠調(diào)控線蟲的相應(yīng)機(jī)能。SKN-1與機(jī)體的代謝、線蟲衰老和壽命密切相關(guān)，并受胰島素信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號等多途徑調(diào)控，提示OsPrx3蛋白增強(qiáng)動物抵御氧化的能力很可能具有復(fù)雜機(jī)制。以上結(jié)果表明，OsPrx3在作物品質(zhì)升級、促進(jìn)人體健康方面的應(yīng)用潛能。

總之，本研究采用體外DNA缺刻實(shí)驗(yàn)證實(shí)了紅米稻OsPRx3具有較強(qiáng)的抑制DNA氧化損傷功能，為探索紅米稻重要蛋白因子的功能及其運(yùn)用提供了理論基礎(chǔ)。

作者簡介

通信作者：

方慶，湖北民族大學(xué)副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)橹参锬婢尺m應(yīng)性調(diào)控與蛋白工程。先后主持或參與完成國家自科基金、中國博士后基金及湖北省自然科學(xué)基金等科研項(xiàng)目，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊已發(fā)表研究論文或報告20余篇。曾獲全國大學(xué)生生命科學(xué)競賽優(yōu)秀指導(dǎo)教師等榮譽(yù)。

第一作者：

汪海洋，碩士，工程師；本科和碩士畢業(yè)于湖北民族大學(xué)，碩士研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)，期間發(fā)表研究論文6 篇，曾獲湖北民族大學(xué)研究生獎學(xué)金。

本文《過氧化物還原酶OsPrx3抑制DNA氧化損傷的功能》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第20期162-169頁，作者：汪海洋，趙玉楠，盧延克，黃卉，王智勇，方慶。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250509-041。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：南伊；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)