在白酒的釀造過程中，隨著時(shí)間推移，環(huán)境因子的改變與生物因素驅(qū)動(dòng)著酒醅微生物進(jìn)行組裝與演替，微生物群落的組裝是指微生物群落從無到有或從簡單到復(fù)雜的形成過程，描述了不同微生物種群如何通過一系列生態(tài)過程（如選擇、擴(kuò)散、漂變和物種形成）在特定環(huán)境中聚集并形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)。而群落的演替是指在一定環(huán)境條件下，微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)和功能隨時(shí)間推移而發(fā)生的有序、可預(yù)測的變化過程。微生物在組裝與演替的過程中代謝各種風(fēng)味物質(zhì)并積累。

芽孢桿菌（

Bacillus

）是濃香型白酒釀造過程中重要的功能菌屬，與酵母菌、乳桿菌以及霉菌等白酒釀造過程中的關(guān)鍵微生物聯(lián)系緊密，同時(shí)能代謝產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多種酶，芽孢桿菌的增加或減少會(huì)影響酒醅微生物的群落結(jié)構(gòu)。微生物間的相互作用也會(huì)影響群落的組裝過程，而通過網(wǎng)絡(luò)分析可以量化微生物相互作用，進(jìn)一步分析微生物相互作用對(duì)群落組裝的影響。

四川輕化工大學(xué)食品與釀酒工程學(xué)院的曹衛(wèi)林、黃丹*和四川郎酒股份有限公司的沈毅*等從濃香型酒廠取得攤晾拌曲后的酒醅以及窖池當(dāng)中的黃水，其中黃水可以提供濃香型白酒發(fā)酵過程中的窖泥微生物，用攤晾拌曲后的酒醅和黃水構(gòu)建了濃香型白酒酒醅的多菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)體系，同時(shí)加入從濃香型白酒酒醅分離得到的枯草芽孢桿菌（

Bacillus subtilis

JP1）進(jìn)行生物擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)。通過擴(kuò)增子測序技術(shù)和生物信息統(tǒng)計(jì)學(xué)探究發(fā)酵過程酒醅微生物群落組成變化，以及枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物環(huán)境生態(tài)位寬度和相互作用的影響，以期解析枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物群落的組裝過程及演替速度的影響機(jī)制。

1 枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

1.1 枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物多樣性的影響

通過多樣性指數(shù)和主坐標(biāo)分析（PCoA）了解枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微 生物群落

多樣性和

多樣性的影響。發(fā)酵過程中微生物

多樣性的變化見圖1A、B，微生物豐富度用Shannon指數(shù)表示，EG和BG細(xì)菌多樣性指數(shù)有著相似的變化趨勢(shì)，均先下降后上升，在第8天時(shí)達(dá)到最低，隨后上升至23 d后趨于平穩(wěn)，枯草芽孢桿菌的 添加顯著降低了EG的細(xì)菌多樣性，這表明枯草芽孢桿菌可能對(duì)細(xì)菌的生長具有強(qiáng)烈的抑制作用；EG和BG真菌多樣性指數(shù)變化趨勢(shì)也相似，真菌多樣性指數(shù)上升至第8天后開始趨于平穩(wěn)，EG中真菌多樣性指數(shù)在整個(gè)發(fā)酵過程中總體都低于BG，說明芽孢桿菌能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，可能導(dǎo)致了微生物多樣性的降低?；贐ray-Curtis距離對(duì)EG和BG在發(fā)酵期間的微生物進(jìn)行PCoA，由圖1C、D可知，BG與EG的置信橢圓顯示酒醅微生物在發(fā)酵過程中有顯著的階段性特征（P1：0～16 d，P2：23～40 d），酒醅發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)往往具有階段性特征，且這種階段差異是由于微生物群落對(duì)外部條件的適應(yīng)而產(chǎn)生。與BG相比，真菌在EG中的階段性特征更弱，枯草芽孢桿菌改變了真菌群落的演替。另外，EG和BG發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落和真菌群落分布均有明顯的分離，ANOSIM分析表明兩組間差異顯著（

P

＜0.01）（細(xì)菌（相對(duì)強(qiáng)度

R

＝0.503 8）、真菌（

R

＝0.228 9）），說明枯草芽孢桿菌對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)造成了影響。這些改變這可能是酒醅微生物群落中微生物相互作用的調(diào)節(jié)，或者由于芽孢桿菌分泌各種次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而對(duì)群落的結(jié)構(gòu)和演替造成了影響。

1.2 枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物群落組成的影響

濃香型白酒的發(fā)酵是微生物群落動(dòng)態(tài)變化同時(shí)發(fā)酵的過程，對(duì)發(fā)酵過程微生物組成動(dòng)態(tài)變化的了解有助于探究枯草芽孢桿菌對(duì)菌群組裝及演替的影響。采用高通量擴(kuò)增子測序技術(shù)，從酒培中獲得了1 482 203 條細(xì)菌和1 794 103 條真菌的高質(zhì)量序列，稀疏曲線表明，從酒醅獲得的序列飽和，因此確保了測序數(shù)據(jù)的充分性，其中參與發(fā)酵過程的細(xì)菌有27 門、62 綱、151 目、274 科、550 屬，真菌有7 門、23 綱、65 目、189 科、381 屬。

如圖2A所示，BG和EG中微生物組成變化相似，發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有芽孢桿菌屬（

Bacillus

）、乳桿菌屬（

Lactobacillus

）、類芽孢桿菌屬（

Paenibacillus

）、醋桿菌屬（

Acetobacter

）、葡萄球菌屬（

Staphylococcus

）、棲熱菌屬（

Thermus

）、不動(dòng)桿菌屬（

Acinetobacter

）等。

Lactobacillus

在發(fā)酵初期占比較大，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減少，與之前研究相似，而

Paenibacillus

Acetobacter

的占比隨著發(fā)酵不斷增加。與BG相比，EG中初始細(xì)菌組成由于添加了枯草芽孢桿菌，使得Bacillus在第0天相對(duì)豐度增加，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)兩組的Bacillus相對(duì)豐度接近，微生物群落有一定抵抗外來物種入侵能力，同時(shí)Bacillus是濃香型白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)物種之一，與其他酒醅微生物在長期馴化過程中有著獨(dú)特關(guān)系網(wǎng)，實(shí)驗(yàn)增加了初始Bacillus的相對(duì)含量，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行又回到了其在群落中的生態(tài)位上，執(zhí)行其功能。基于線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)量（LDA effect size，LEfSe）分析（LDA≥2，

P

＜0.05）獲得組間具有顯著差異的細(xì)菌信息（圖2C），差異細(xì)菌有紅球菌屬（

Rhodococcus

）、黃桿菌屬（

Flavobacterium

）、氣單胞菌屬（

Aeromonas

）、普雷沃氏菌屬（

Prevotella

）等。

如圖2B所示，BG和EG中的優(yōu)勢(shì)真菌屬有未分類的曲霉屬（unclassified_f__Aspergillaceae）、曲霉屬（

Aspergillus

）、伊薩酵母屬（

Issatchenkia

）、紅曲霉屬（

Monascus

）、哈薩克斯坦酵母屬（

Kazachstania

）、復(fù)膜孢酵母屬（

Saccharomycopsis

）等，其中unclassified_f__Aspergillaceae在發(fā)酵初期占比很大，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減少，

Issatchenkia

Kazachstania

隨著發(fā)酵進(jìn)行豐度增加。

Aspergillus

在BG中是主要菌屬，在整個(gè)發(fā)酵過程相對(duì)豐度在30%左右，而在EG中相對(duì)豐度顯著下降（7%左右），這可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌對(duì)

Aspergillus

產(chǎn)生拮抗作用；

Monascus

在EG后期占比增加，LEfSe分析結(jié)果（圖2D）顯示

Monascus

是EG與BG兩組的顯著差異微生物，

Monascus

Bacillus

有著代謝合作，常用于其他發(fā)酵產(chǎn)品制備。其余差異真菌屬有

Aspergillus

、有孢漢遜酵母屬（

Saccharomycodes

）、畢赤酵母屬（

Pichia

Kazachstania

等，后三者相對(duì)豐度在EG中更高。Pichia是產(chǎn)乙醇的重要貢獻(xiàn)者，其相對(duì)豐度提高，這可能會(huì)給環(huán)境因子帶來改變，影響微生物群落的組裝過程。

2 枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物群落構(gòu)建的影響

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物群落組裝過程的影響

基于零模型（999 個(gè)隨機(jī)化）計(jì)算了β最接近的分類單元指數(shù)（βNTI），用以評(píng)估芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物發(fā)酵過程隨機(jī)性過程和確定性過程對(duì)群落組裝機(jī)制的影響[33]。如圖3A、C所示，在發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌均受隨機(jī)性過程（|βNTI|＜2）以及確定性過程（|βNTI|＞2）影響，且主要是由隨機(jī)性過程主導(dǎo)。在βNTI基礎(chǔ)上，利用Raup-Crick指數(shù)（RCbary值）將確定性過程和隨機(jī)過程劃分為5 個(gè)生態(tài)過程并確定每個(gè)生態(tài)過程的相對(duì)重要性[34]。由圖3B、D可知，枯草芽孢桿菌影響了酒醅發(fā)酵過程中微生物群落的組裝過程。細(xì)菌群落中，同質(zhì)選擇對(duì)群落組裝的貢獻(xiàn)從19.44%增到了20.33%，異質(zhì)選擇從0.00%增加到2.77%，擴(kuò)散限制從13.88%降至4.16%，同質(zhì)擴(kuò)散從9.72%降至8.33%，生態(tài)漂移從56.94%增至63.88%。真菌群落中，同質(zhì)選擇對(duì)群落的貢獻(xiàn)從5.55%增加至22.22%，異質(zhì)選擇從9.72%降至6.94%，擴(kuò)散限制從8.33%增加至41.66%，生態(tài)漂移從76.38%降至29.16%。

這些結(jié)果表明，隨機(jī)過程在酒醅發(fā)酵過程中主導(dǎo)了微生物群落的組裝，但枯草芽孢桿菌的加入改變了異質(zhì)選擇、同質(zhì)選擇、擴(kuò)散限制、同質(zhì)擴(kuò)散和生態(tài)漂移對(duì)群落組裝的貢獻(xiàn)，導(dǎo)致了發(fā)酵過程微生物群落的分化。細(xì)菌的異質(zhì)選擇過程從0.00%增加至2.77%，真菌的同質(zhì)選擇過程貢獻(xiàn)從5.55%增加至22.22%，使酒醅微生物群落的組裝過程更具確定性。確定性過程保留了適應(yīng)性強(qiáng)的微生物，從而增強(qiáng)了某些群落特有的功能，隨機(jī)性過程可以豐富物種的功能多樣性，有助于維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，因此確定性過程的增加可能導(dǎo)致了群落在組裝過程中物種多樣性的降低。確定性過程是由生物因素及非生物因素共同決定，確定性過程的增加，說明枯草芽孢桿菌的加入可能導(dǎo)致環(huán)境因子及微生物相互作用發(fā)生了改變。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵過程中酒醅理化指標(biāo)的影響

酒醅發(fā)酵過程中理化因子的變化與微生物群落演替及代謝情況密切相關(guān)，酒醅的水分含量、乙醇含量、還原糖和總酸含量變化情況如圖4所示。其中水分含量和乙醇含量作為感官上最直觀的理化參數(shù)之一，對(duì)微生物組生長代謝具有顯著的驅(qū)動(dòng)作用。BG與EG的水分含量和乙醇含量呈現(xiàn)了相似的變化趨勢(shì)，均表現(xiàn)為第0～16天快速上升，第16～40天開始下降并趨于平緩，其中發(fā)酵第16天時(shí)酒醅乙醇含量達(dá)到最大值，BG和EG組分別為（8.35±0.07）、（9.73±0.07）mL/100 g。還原糖作為微生物群落的基本營養(yǎng)物質(zhì)，在酒醅發(fā)酵中扮演著至關(guān)重要的作用。在發(fā)酵第0～8天，BG與EG的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)增加并達(dá)到最大，最大值分別為（8.90±0.13）%、（9.06±0.15）%，這可能是起始酒醅微生物快速分解淀粉導(dǎo)致還原糖含量上升，芽孢桿菌屬是α-葡萄糖苷酶（3.2.1.20）基因的優(yōu)勢(shì)微生物，EG中高豐度的芽孢桿菌導(dǎo)致了其擁有更高的還原糖含量。BG與EG的總酸含量在發(fā)酵第0～16天時(shí)，上升速率最快，分別為（0.45±0.03）、（0.44±0.01）mmol/10 g。在發(fā)酵第16～40天時(shí)，EG的總酸含量顯著高于BG。各理化指標(biāo)在0～23 d內(nèi)均有較大變化，在23 d后變化幅度減小。受枯草芽孢桿菌的影響，EG與BG的理化指標(biāo)有著相似的變化趨勢(shì)，但變化幅度有所不同。

2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物環(huán)境生態(tài)位寬度的影響

環(huán)境的改變會(huì)導(dǎo)致生態(tài)位重構(gòu)，這驅(qū)動(dòng)了細(xì)菌或真菌群落的聚集，前面的分析指明，加入枯草芽孢桿菌后，酒醅發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)變化發(fā)生了顯著差異，為了探究這種改變對(duì)酒醅微生物的影響，通過計(jì)算物種在兩個(gè)發(fā)酵體系中的環(huán)境生態(tài)位寬度，可以了解該物種對(duì)環(huán)境資源的利用程度和適應(yīng)能力的改變。根據(jù)Jiao Shuo等的方法計(jì)算了每個(gè)物種分別在EG和BG中的環(huán)境生態(tài)位寬度，對(duì)環(huán)境生態(tài)位寬度增加或減少的物種數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，同時(shí)為了表征群落內(nèi)部的微生物變化情況，根據(jù)微生物的相對(duì)豐度將其劃分為6 個(gè)亞群落：稀有類群、豐富類群、中間類群、條件稀有類群、條件豐富類群、條件稀有或豐富類群。

如圖5A、B所示，細(xì)菌菌群中，與BG相比，EG中大部分物種的環(huán)境生態(tài)位寬度都降低，同時(shí)降低了整個(gè)細(xì)菌群落的生態(tài)位寬度，而真菌群落中環(huán)境生態(tài)位寬度下降與上升的物種數(shù)量相當(dāng)，真菌群落整體的生態(tài)位寬度變化也不大，說明枯草芽孢桿菌對(duì)細(xì)菌菌屬的生態(tài)位寬度影響大于真菌，這種差異表明真菌群落中微生物占據(jù)更廣的生態(tài)位寬度，對(duì)環(huán)境變化具有更高的適應(yīng)能力以及抵抗能力，在環(huán)境改變后依然能更廣泛的利用資源。EG中細(xì)菌、真菌的稀有類群的數(shù)量都顯著增加，同時(shí)條件稀有類群和條件稀有或豐富類群的物種數(shù)量顯著降低，說明EG當(dāng)中微生物的生存壓力更大，導(dǎo)致一些物種相對(duì)豐度在整個(gè)發(fā)酵過程中下降甚至是消失?？莶菅挎邨U菌的添加影響了酒醅微生物的環(huán)境生態(tài)位寬度，這可能解釋了酒醅微生物多樣性的變化。

為了明確環(huán)境生態(tài)位寬度的改變對(duì)酒醅微生物亞群落組成的影響，計(jì)數(shù)EG和BG各亞群落的共有成員。如圖5C、D所示，細(xì)菌群落中EG和BG的稀有類群和條件稀有類群共有成員最多；其次在EG當(dāng)中的稀有類群和BG當(dāng)中的條件稀有類群有36 個(gè)共有成員，相比于BG，EG有21 個(gè)成員的環(huán)境生態(tài)位寬度有所下降。真菌群落中EG的稀有類群和BG的條件稀有類群共有成員最多，總共97 個(gè)，有68 個(gè)的環(huán)境生態(tài)位寬度下降。條件稀有類群相對(duì)于稀有類群，在微生物群落中擁有更高的相對(duì)豐度，EG中稀有類群與BG中條件稀有類群的高相似度，說明大多數(shù)微生物在EG當(dāng)中相對(duì)豐度下降，同時(shí)環(huán)境生態(tài)位寬度的降低，證明了微生物對(duì)環(huán)境的利用程度和范圍降低，枯草芽孢桿菌通過影響濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物的環(huán)境生態(tài)位寬度進(jìn)而導(dǎo)致稀有類群物種數(shù)的增加。而稀有類群對(duì)環(huán)境更敏感，稀有菌群與優(yōu)勢(shì)菌群的占比會(huì)影響群落對(duì)環(huán)境干擾的抵抗與恢復(fù)能力，因而可能會(huì)對(duì)酒醅發(fā)酵過程中微生物群落的演替速度與方向造成影響。

2.4 枯草芽孢桿菌對(duì)酒醅微生物群落演替速率的影響

枯草芽孢桿菌的加入影響了酒醅中微生物的生態(tài)位重構(gòu)，微生物亞群落結(jié)構(gòu)改變，同時(shí)各亞群落的環(huán)境生態(tài)位寬度改變，如圖6A～C所示，展示了酒醅微生物主要的3 個(gè)亞群落的環(huán)境生態(tài)位寬度變化，細(xì)菌中稀有類群的環(huán)境生態(tài)位寬度顯著下降，條件稀有類群和條件稀有或豐富類群的環(huán)境生態(tài)位寬度無顯著變化；真菌中稀有類群和條件稀有類群的環(huán)境生態(tài)位寬度顯著上升，而條件稀有或豐富類群的環(huán)境生態(tài)位寬度顯著下降。稀有類群對(duì)環(huán)境的響應(yīng)與變化，對(duì)微生物群落總體差異貢獻(xiàn)大于豐富類群，這影響了微生物群落的演替速率（圖6D、E）。酒醅發(fā)酵過程中細(xì)菌稀有類群數(shù)量及占比增加，優(yōu)勢(shì)物種（相對(duì)豐度＞1%）數(shù)減少，且稀有類群的環(huán)境生態(tài)位寬度降低，更容易受環(huán)境影響而改變，加快了酒醅發(fā)酵過程細(xì)菌群落的演替速度。而真菌稀有物種數(shù)量增加，但相對(duì)于BG，EG中稀有類群和條件稀有類群的環(huán)境生態(tài)位寬度增加，減弱了亞群落受環(huán)境的影響，降低了真菌群落演替速度。

3 枯草芽孢桿菌酒醅微生物相互作用的影響

環(huán)境的改變推動(dòng)了微生物群落的演替，同時(shí)微生物間相互作用也會(huì)推動(dòng)群落的演替，為了研究芽孢桿菌對(duì)酒醅發(fā)酵過程中微生物相互作用的影響，基于Spearman相關(guān)性系數(shù)構(gòu)建了微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)（|

r

|＞0.8、

P

＜0.05）。

由圖7A、B可知，BG的微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共分為5 個(gè)模塊、211 個(gè)節(jié)點(diǎn)、512 條邊，網(wǎng)絡(luò)平均加權(quán)度6.029，模塊化系數(shù)0.879。EG的網(wǎng)絡(luò)共分為5 個(gè)模塊、262 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 851 條邊，網(wǎng)絡(luò)平均加權(quán)度23.816，模塊化系數(shù)0.551。EG網(wǎng)絡(luò)中的稀有類群和條件稀有類群占比增加，而豐富類群以及條件稀有或豐富類群的占比下降。EG中微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)平均加權(quán)度與邊數(shù)顯著增加，且模塊化系數(shù)降低。如圖7C、D所示，相比BG，EG網(wǎng)絡(luò)中各模塊的條件稀有類群的占比增加，且稀有類群和條件稀有類群在各模塊中分別變得均勻。稀有類群與條件稀有類群對(duì)環(huán)境變化更加敏感，兩者在各模塊中分布的增加可能推動(dòng)微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。

這些結(jié)果說明枯草芽孢桿菌增加了稀有類群的數(shù)量與種類，增強(qiáng)了稀有類群在微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的功能，同時(shí)微生物網(wǎng)絡(luò)的模塊化程度降低，微生物之間關(guān)系更復(fù)雜，微生物網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性降低，特別的，實(shí)驗(yàn)組共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中最大的模塊1全是細(xì)菌，而第3大的模塊3也僅有3 個(gè)真菌屬，兩模塊分別占了網(wǎng)絡(luò)的18.70%和16.79%，芽孢桿菌的增加使得細(xì)菌群落內(nèi)部聯(lián)系更緊密，使細(xì)菌群落更不穩(wěn)定，推動(dòng)了細(xì)菌群落的組裝與演替。

結(jié) 論

枯草芽孢桿菌擾動(dòng)了濃香型白酒釀造過程中酒醅微生物群落的組裝過程，改變了酒醅微生物亞群落的分布與組成?？莶菅挎邨U菌的加入使乙醇、還原糖以及總酸含量增加，環(huán)境因子的改變導(dǎo)致了在發(fā)酵過程中酒醅微生物的生態(tài)位重構(gòu)差異，微生物在群落中可利用環(huán)境資源程度及環(huán)境適應(yīng)性發(fā)生改變，使酒醅微生物群落的組裝過程發(fā)生改變，細(xì)菌異質(zhì)選擇與真菌同質(zhì)選擇對(duì)群落組裝的貢獻(xiàn)增加，酒醅微生物的群落組裝過程變得更具確定性。微生物環(huán)境生態(tài)位寬度的變化改變了亞群落的數(shù)量以及其組成，而亞群落對(duì)環(huán)境的響應(yīng)不同，不同亞群落的占比影響了酒醅微生物群落的演替速度，枯草芽孢桿菌的加入加快了細(xì)菌群落的演替，而降低了真菌群落的演替速度。本研究結(jié)果揭示了枯草芽孢桿菌對(duì)濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落的構(gòu)建及群落演替的影響，對(duì)白酒釀造過程中微生物生態(tài)學(xué)研究具有重要意義。

本文《 枯草芽孢桿菌對(duì)濃香型白酒酒醅微生物群落組裝模式的影響 》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第15期164-173 頁， 作者： 曹衛(wèi)林，張亞東，向港興，蔡海燕，王超凱，羅惠波，夏 玙，黃 丹*，沈 毅* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250110-075 。 點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：林安琪；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)