植物時間生物學(xué)（生物鐘）旨在從分子細(xì)胞水平揭示內(nèi)源計(jì)時機(jī)制及其如何賦予植物更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。生物鐘在作物引種馴化、高光效、抗逆性、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、水肥和農(nóng)藥高效利用等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。迄今為止，該領(lǐng)域建立的植物生物鐘多重轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路（transcription–translation feedback loops, TTFLs）模型依然處在不斷完善過程之中，特別是生物鐘如何精確維持近24小時節(jié)律及關(guān)鍵組分時間特異性表達(dá)的生物學(xué)意義是領(lǐng)域內(nèi)備受關(guān)注的科學(xué)問題，亟待深入研究。

PRR（PSEUDO-RESPONSE REGULATOR）作為植物生物鐘核心組分，在從低等到高等植物進(jìn)化中拷貝數(shù)大幅增加，其在模式植物擬南芥中共有5個拷貝和1個假基因，從清晨到傍晚約2小時間隔依次節(jié)律性表達(dá)，形成“五重奏”現(xiàn)象。PRRs-CCA1/LHY模塊在生物鐘穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮著核心作用，以PRRs為突破口研究時間特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控有助于深入理解生物鐘TTFLs調(diào)控機(jī)制及其如何增強(qiáng)植物環(huán)境適應(yīng)能力。

近日，河南大學(xué)謝啟光和徐小冬教授研究團(tuán)隊(duì)在期刊Plant,Cell& Environment發(fā)表了題為“Cis-Regulatory Architecture of PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 9 and Its Role in the Integration of the Plant Circadian Clock andEnvironmentalSignalling”的論文，該研究表明目前有關(guān)生物鐘清晨或傍晚轉(zhuǎn)錄復(fù)合體決定PRR9節(jié)律性表達(dá)的模型需要重新審視：PRR9節(jié)律表達(dá)取決于一段此前未被表征的27 bp啟動子序列，該序列不含任何已知生物鐘相關(guān)基序。該發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了“僅由生物鐘相關(guān)順式作用元件決定生物鐘基因節(jié)律表達(dá)”的普遍觀點(diǎn)；同時證明了PRR9在轉(zhuǎn)錄水平時間特異性響應(yīng)光照和溫度信號可能有助于植物獲得生長優(yōu)勢。

本研究利用啟動子逐段敲除、定點(diǎn)誘變，構(gòu)建了一系列PRR9啟動子驅(qū)動的LUC報(bào)告基因來鑒定對光、溫度、晝夜和近日節(jié)律調(diào)控有響應(yīng)的順式元件。首先，通過系統(tǒng)性缺失法，作者構(gòu)建了啟動子5'-端截短突變體，以鑒定在晝夜節(jié)律和生物鐘條件下影響轉(zhuǎn)錄豐度與節(jié)律性的片段。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因擬南芥株系后，篩選足夠數(shù)量的純合植株進(jìn)行生物發(fā)光分析。每種構(gòu)建體從約24株隨機(jī)篩選的轉(zhuǎn)基因植株中，至少選取三株具有代表性LUC強(qiáng)度和節(jié)律表型的純合植株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。高靈敏度CCD相機(jī)生物發(fā)光成像揭示：PRR9轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度受上游啟動子片段調(diào)控。刪除?611至?952 bp區(qū)域（命名為F24片段）顯著降低了LUC活性（圖1b、c），表明該區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子功能。

圖1. PRR9基因啟動子區(qū)含有順式作用元件，可調(diào)控其自身轉(zhuǎn)錄豐度、晝夜節(jié)律性及光響應(yīng)。

為解決這一問題，作者對PRR9啟動子進(jìn)行了詳細(xì)分析，以識別對節(jié)律性轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要的區(qū)域。先前研究表明，將PRR9啟動子的F24片段與D8片段融合后，既能恢復(fù)LUC信號強(qiáng)度又能恢復(fù)節(jié)律性——盡管F24本身是通用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子而非節(jié)律決定因子。這表明D8片段（-1至-362 bp）在PRR9節(jié)律性中起關(guān)鍵作用——該區(qū)域雖含一個EE位點(diǎn)和兩個SORLIP位點(diǎn)，卻缺乏其他已知的晝夜節(jié)律順式作用元件。然而，其他啟動子區(qū)域是否參與調(diào)控仍不明確。先前研究發(fā)現(xiàn)?277至?396 bp區(qū)域?qū)RR9在晝夜節(jié)律周期中的節(jié)律性至關(guān)重要，但具體負(fù)責(zé)該功能的序列尚未確定。為深入探究，作者系統(tǒng)性地刪除特定啟動子片段，同時保留完整PRR9啟動子以避免對轉(zhuǎn)錄豐度產(chǎn)生干擾效應(yīng)（圖2a）。生物發(fā)光成像顯示，D10和D11構(gòu)建體在LD、LL及CC條件下均保持節(jié)律性，而D12和D13則呈現(xiàn)無節(jié)律表型（圖2b、d、f）。結(jié)合圖1數(shù)據(jù)，這些結(jié)果精準(zhǔn)定位了?233至?391 bp區(qū)域?qū)RR9晝夜節(jié)律至關(guān)重要。該160 bp區(qū)域包含SORLIP和EE基序。為進(jìn)一步縮小調(diào)控PRR9節(jié)律性表達(dá)的啟動子序列范圍，作者敲除了這段約160 bp區(qū)域。D15構(gòu)建體（移除SORLIP1/2及其側(cè)翼區(qū)域）仍保持節(jié)律性表達(dá)，而D17構(gòu)建體（剔除-272至-246 bp片段，不含EE基序及其上游四個核苷酸）則導(dǎo)致表達(dá)失調(diào)（圖2c、e、g）。這些發(fā)現(xiàn)鑒定出一個新型27 bp順式作用元件（5′-TATACAACAAAGTCTTCTTCTTTCTCT-3′），該元件對光照和溫度同步條件下PRR9的節(jié)律性轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。值得注意的是，該序列不含任何已知的經(jīng)典晝夜節(jié)律順式作用元件。

圖2. 新型27 bp順式作用元件調(diào)控PRR9的近日節(jié)律性。

該研究推測PRR9對光的響應(yīng)可能由多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合多個位點(diǎn)來調(diào)控。研究結(jié)果表明，PRR9對溫度的響應(yīng)主要通過位于其啟動子上游較遠(yuǎn)位置的HSF結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)，并受晝夜節(jié)律時鐘的調(diào)控。先前的研究表明，PRR7也通過 HsfB2b 受熱調(diào)控。作者認(rèn)為，這證明從溫度響應(yīng)的角度來看，PRR9和PRR7在很大程度上具有功能互補(bǔ)性。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，PRR9對光敏感，這可能與其參與重置生物鐘有關(guān)。自然界中生長的植物每天都會經(jīng)歷光周期的逐漸變化，而光可調(diào)控的生物鐘對于生長發(fā)育階段的光周期響應(yīng)至關(guān)重要。作者初步證明PRR9參與了光對生物鐘的重置（圖3），并且可能也參與了溫度對生物鐘的重置。

圖3. PRR9的時空特異性表達(dá)賦予其特定生理功能。

河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/作物逆境適應(yīng)與改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的謝啟光、徐小冬教授為論文共通訊作者，在讀博士生劉玉潔、特聘教授劉明明博士為論文第一作者，在讀研究生王曉雨、連夢麗、已畢業(yè)研究生宋佳麗、丁立煥參與了該項(xiàng)研究；團(tuán)隊(duì)在生物鐘領(lǐng)域的相關(guān)研究得到了國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、十四五重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、河南省科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才、河南大學(xué)雙一流建設(shè)學(xué)科經(jīng)費(fèi)的支持。

通訊作者謝啟光教授，武漢大學(xué)發(fā)育生物學(xué)專業(yè)理學(xué)博士；美國加州大學(xué)河邊分校、美國范德堡大學(xué)、美國達(dá)特茅斯學(xué)院副研究員；現(xiàn)任河南大學(xué)省部共建作物逆境適應(yīng)與改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題組長、教授、博士生導(dǎo)師。入選河北省“百人計(jì)劃”、省級特聘專家、現(xiàn)任中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會生物節(jié)律分會常務(wù)委員。課題組研究方向?yàn)椤白魑锷镧娕c重要農(nóng)藝性狀調(diào)控機(jī)理”：側(cè)重于闡明植物/作物生物鐘多重轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路的分子機(jī)理，同時力圖揭示作物生物鐘調(diào)控栽培地域性和脅迫抗性的機(jī)制。入選河北省“百人計(jì)劃”、省級特聘專家、現(xiàn)任中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會生物節(jié)律分會常務(wù)委員。累計(jì)發(fā)表近50篇學(xué)術(shù)及專著文章，其中以通訊或第一作者身份在Plant Cell、PNAS、Nature Communications、Plant Cell Environ、J Integr Plant Biol、Theor Appl Genet等期刊發(fā)表論文20余篇；成果并多次被本領(lǐng)域同行的綜述文章所引用，其中涉及生物鐘新組分和新機(jī)制的內(nèi)容，包括LNK1/2、BBX18/19、COR27/28、SKIP等已經(jīng)繪入植物生物鐘領(lǐng)域工作模型之中。

https://doi.org/10.1111/pce.70293