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MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）是分子進(jìn)化分析專用集成軟件，以圖形化界面簡化生物信息學(xué)分析流程，無需編程基礎(chǔ)即可完成序列比對(duì)、進(jìn)化樹構(gòu)建、遺傳距離計(jì)算等核心操作，廣泛應(yīng)用于病毒溯源、物種分化、基因家族進(jìn)化等研究領(lǐng)域。其核心優(yōu)勢(shì)在于：

• 支持核苷酸 / 蛋白質(zhì)序列全流程分析，功能覆蓋從數(shù)據(jù)預(yù)處理到結(jié)果可視化；

• 集成鄰接法（NJ）、最大似然法（ML）等主流建樹算法，適配不同研究需求；

• 跨 Windows、MacOS、Linux 系統(tǒng)，且完全免費(fèi)開源。

核心功能一：多序列比對(duì)

多序列比對(duì)是系統(tǒng)發(fā)育分析的前置核心步驟，需確保序列同源性區(qū)域?qū)R。MEGA 支持 ClustalW、MUSCLE 兩種主流算法，以下以常用的 ClustalW 比對(duì)核苷酸序列為例：

1. 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備：

• 支持格式：優(yōu)先使用 Fasta 格式（最通用），也支持 Clustal、GenBank 等格式；

• 數(shù)據(jù)來源：可從 NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫下載目標(biāo)序列（主要有核酸序列和蛋白質(zhì)序列），或使用實(shí)驗(yàn)室測序數(shù)據(jù)。此處以 TP53 蛋白序列為例，盡量選擇大小相近的蛋白，然后在右上角的 send to 選擇 FASTA 格式下載。

2. 詳細(xì)比對(duì)步驟：

• 導(dǎo)入序列文件：點(diǎn)擊主界面「File → Open a File/Session」，選擇準(zhǔn)備好的 Fasta 文件；

• 在彈出窗口中選擇 Align；

• 然后進(jìn)行序列規(guī)整，單擊菜單【Alignment】→【Align by ClustalW】，彈出參數(shù)設(shè)置窗口，保持默認(rèn)參數(shù)（新手推薦），關(guān)鍵參數(shù)說明：

Gap Opening Penalty：10（間隙打開罰分，數(shù)值越大越難出現(xiàn)間隙）；

Gap Extension Penalty：0.2（間隙延伸罰分，數(shù)值越小間隙越長）；

DNA Weight Matrix：IUB（核苷酸比對(duì)默認(rèn)矩陣）；

點(diǎn)擊「OK」，等待比對(duì)完成（進(jìn)度條顯示，小規(guī)模序列需 1-3 分鐘）。

• 比對(duì)結(jié)果檢查與調(diào)整：比對(duì)完成后自動(dòng)顯示對(duì)齊的序列；

檢查要點(diǎn)：

同源區(qū)域是否連續(xù)對(duì)齊（無大量錯(cuò)位間隙）；

兩端冗余序列是否過多（可手動(dòng)裁剪）；

手動(dòng)調(diào)整：選中錯(cuò)位區(qū)域，右鍵選擇「Delete」刪除無效列。

• 最后單擊菜單【Data】→【Save Session】，保存序列比對(duì)的結(jié)果。

核心功能二：系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

MEGA 支持鄰接法（NJ）、最大似然法（ML）、最小進(jìn)化法（ME）等，其中鄰接法（NJ）計(jì)算快、適用性廣，適合新手入門；最大似然法（ML）精度更高，適合發(fā)表級(jí)分析。下面是具體操作步驟：

1. 把上面保存的 meg 文件拖拽到 MEGA 軟件中。

2. 點(diǎn)擊 Phylogeny—— 選擇近鄰法繪制進(jìn)化樹（Construct/Test Neighbor-Joining Tree），彈框選擇 yes；

3. 參數(shù)設(shè)置（關(guān)鍵！影響建樹可靠性）：

彈出「Analysis Preferences」窗口，按以下推薦設(shè)置：

• Test of Phylogeny：選擇「Bootstrap method」（自舉檢驗(yàn)，評(píng)估分支可靠性），設(shè)置「Bootstrap replications」為 1000（推薦值，重復(fù) 1000 次檢驗(yàn)，數(shù)值越高越可靠）；

• Model/Method：選擇遺傳距離模型，核苷酸序列推薦「Kimura 2-parameter」（K2P 模型，考慮堿基轉(zhuǎn)換 / 顛換差異），蛋白質(zhì)序列推薦「JTT」模型；

• Rate among Sites：新手保持「Uniform rates」（均勻速率，復(fù)雜分析可選 Gamma 分布）；

• Gaps/Missing Data：選擇「Pairwise deletion」（成對(duì)刪除含缺失數(shù)據(jù)的位點(diǎn)，保留更多有效數(shù)據(jù)）；

點(diǎn)擊「OK」開始計(jì)算。

4. 結(jié)果解讀與可視化：

計(jì)算完成后自動(dòng)彈出結(jié)果窗口，顯示 NJ 樹，可以在上方選擇樹的樣式，例如繪制一個(gè)圓形的樹，或一個(gè)經(jīng)典的樹：

核心元素解讀：

• 葉節(jié)點(diǎn)：代表輸入的物種 / 序列（標(biāo)注名稱與 accession 號(hào)）；

• 內(nèi)部節(jié)點(diǎn)：代表推測的共同祖先；

• 分支長度：表示進(jìn)化距離（數(shù)值越小親緣關(guān)系越近）；

• Bootstrap 值：分支上的數(shù)字（0-100），≥70 表示該分支可靠性高；

5. 結(jié)果保存：（適配期刊要求）

• 導(dǎo)出樹形文件：點(diǎn)擊「File → Export Current Tree」，選擇：

Newick 格式（*.nwk）：用于其他軟件（如 FigTree）進(jìn)一步編輯；

MEGA 格式（*.mts）：保存當(dāng)前會(huì)話，便于后續(xù)修改。

• 導(dǎo)出圖片：點(diǎn)擊 Image，選擇高分辨率格式，推薦 PNG（300 DPI）或 TIFF（600 DPI，發(fā)表首選）；

常見問題與避坑指南（Q&A）

1. 序列比對(duì)亂序，無法建樹？

可能原因：序列同源性過低（<50%）或格式錯(cuò)誤；

解決方法：

① 用 NCBI BLAST 驗(yàn)證序列同源性，剔除異源序列；

② 檢查 Fasta 格式，確保每個(gè)序列的「>」后無空格，序列無換行錯(cuò)誤。

2. Bootstrap 值普遍偏低（<50）？

可能原因：序列長度過短、樣本量不足或比對(duì)質(zhì)量差；

解決方法：① 增加序列長度（≥500bp）；

② 補(bǔ)充近緣物種序列；

③ 重新優(yōu)化比對(duì)（刪除冗余間隙列）。

3. 建樹時(shí)提示 「內(nèi)存不足」？

可能原因：序列數(shù)量過多（>100 條）或序列過長；

解決方法：① 分批次分析，先構(gòu)建核心物種樹；

② 關(guān)閉其他軟件釋放內(nèi)存；

③ 選擇計(jì)算更快的 NJ 法替代 ML 法。

4. 如何選擇遺傳距離模型？

核苷酸序列：默認(rèn) K2P 模型（通用），若 GC 含量差異大，選 GTR 模型；

蛋白質(zhì)序列：默認(rèn) JTT 模型，若含跨物種序列，選 WAG 模型；

5. 打開 FASTA 文件后，序列名稱只顯示一部分是什么原因？

可能原因：這是 MEGA 的默認(rèn)設(shè)置，序列名稱會(huì)顯示到第一個(gè)空格為止。

解決方法：無需修改文件，點(diǎn)擊軟件中 「display -> show full sequence names」 選項(xiàng)，即可顯示完整的序列名稱，避免因名稱顯示不全誤判序列。

6. 報(bào)錯(cuò)「Error: MEGA has detected duplicate taxa labels」 該如何處理？

可能原因：該報(bào)錯(cuò)是樣本分類單元標(biāo)簽重復(fù)導(dǎo)致軟件無法區(qū)分不同樣本。

解決方法：提前檢查序列文件中所有樣本的名稱，確保每個(gè)標(biāo)簽唯一，可通過添加序號(hào)、物種亞種信息等方式修改重復(fù)標(biāo)簽，修改后重新導(dǎo)入數(shù)據(jù)即可。

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題圖來源：自制

編輯：冷漠小 z