CRISPR–Cas系統(tǒng)作為高效的基因編輯/調(diào)控工具，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是目前FDA批準(zhǔn)用于基因治療的主要遞送載體，但其有限的容量限制了以Cas蛋白為核心的效應(yīng)工具和基因線(xiàn)路的包裝，制約了CRISPR–Cas系統(tǒng)的臨床應(yīng)用。

ISDra2來(lái)源的TnpB蛋白具有高度緊湊的結(jié)構(gòu)（408 aa），其體積顯著小于目前廣泛應(yīng)用的Cas蛋白。與其他Cas蛋白類(lèi)似，TnpB的活性依賴(lài)其向?qū)NA（ωRNA）：ωRNA通過(guò)其spacer序列與靶DNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，引導(dǎo)TnpB定位至鄰近靶序列識(shí)別基序（TAM）的目標(biāo)位點(diǎn)并發(fā)揮基因編輯作用。在基因調(diào)控應(yīng)用中，效應(yīng)功能域融合蛋白通常體積較大，采用緊湊型TnpB-ωRNA系統(tǒng)有望實(shí)現(xiàn)單AAV的體內(nèi)遞送。然而，野生型TnpB-ωRNA系統(tǒng)的基因調(diào)控和編輯效能極其有限，亟需系統(tǒng)性?xún)?yōu)化。

近日，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林天歆、陳旭團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表題為Miniature and versatile genome regulation TnpB–ωRNA toolkits facilitate cancer immunotherapy的研究論文。該研究通過(guò)定向迭代工程化改造TnpB–ωRNA系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了微型、高效的基因調(diào)控工具enTnpB，該工具可實(shí)現(xiàn)基因激活、基因編輯及堿基編輯在內(nèi)的多種功能模塊。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步構(gòu)建了基于單AAV遞送的免疫激活治療工具（AAV-ImmunAct），內(nèi)源性激活腫瘤微環(huán)境中多種關(guān)鍵免疫因子表達(dá)，在人源化模型中展現(xiàn)出優(yōu)秀的抗腫瘤潛力。

本研究通過(guò)定向迭代的工程化策略，對(duì)來(lái)源于ISDra2轉(zhuǎn)座子的TnpB–ωRNA進(jìn)行了系統(tǒng)性?xún)?yōu)化。在RNA層面，研究團(tuán)隊(duì)圍繞ωRNA的結(jié)構(gòu)特征開(kāi)展精細(xì)化改造，包括5′端游離結(jié)構(gòu)區(qū)域截短、stem結(jié)構(gòu)重塑及關(guān)鍵堿基優(yōu)化等，最終獲得長(zhǎng)度從231nt縮短為93 nt的增強(qiáng)型ωRNA（enωRNA）。在蛋白層面，基于TnpB的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)開(kāi)展多輪突變篩選，鑒定出關(guān)鍵突變組合N255R/P282R，其通過(guò)增強(qiáng)蛋白與RNA–DNA復(fù)合體的相互作用顯著提升其靶向效率。基于RNA與蛋白的協(xié)同優(yōu)化最終構(gòu)建出增強(qiáng)型系統(tǒng)enTnpB，其報(bào)告基因激活能力較野生型系統(tǒng)提升達(dá)2889倍。

在此基礎(chǔ)上，研究進(jìn)一步構(gòu)建了以enTnpB為核心的多功能基因調(diào)控體系，涵蓋基因激活（enTnpBa）、基因編輯（enTnpB-GE）及堿基編輯（enTnpB-ABE）等模塊。在基因激活方面，enTnpBa可在多個(gè)內(nèi)源位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其中部分靶基因（如IFN-γ）表達(dá)水平較對(duì)照組提升最高達(dá)1308倍。在基因編輯方面，enTnpB-GE在多個(gè)靶位點(diǎn)均表現(xiàn)出穩(wěn)定的indel編輯效率，較野生型系統(tǒng)提高1.33至109倍，且未檢測(cè)到顯著脫靶效應(yīng)。在堿基編輯方面，enTnpB-ABE可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的A-to-G堿基轉(zhuǎn)換，堿基編輯效率較野生型大幅度提升，同樣未觀察到明顯脫靶現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，enTnpB體系在保持小尺寸優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，兼具高效性、特異性及多功能性，提供了全新的緊湊型基因調(diào)控工具。

研究團(tuán)隊(duì)基于該體系開(kāi)發(fā)了單AAV遞送的免疫激活策略（AAV-ImmunAct），旨在利用enTnpBa驅(qū)動(dòng)腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵免疫因子的內(nèi)源性持續(xù)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該系統(tǒng)顯著提升了CXCL9、IL-15及IFN-γ的表達(dá)，有效增強(qiáng)了CD8? T細(xì)胞的趨化、活化及腫瘤殺傷效應(yīng)。在類(lèi)器官和人源化小鼠模型中，AAV-ImmunAct單藥治療即可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，且與抗PD-1療法聯(lián)用具有明顯的協(xié)同增效作用。

綜上所述，該研究打通了從小型核酸酶TnpB系統(tǒng)性功能優(yōu)化到體內(nèi)治療驗(yàn)證的完整路徑，為緊湊型基因調(diào)控工具的發(fā)展以及AAV介導(dǎo)的基因治療和腫瘤免疫治療提供了新的技術(shù)方向與應(yīng)用前景。

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林天歆教授、陳旭研究員為本文的共同通訊作者，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院博士后盧俊霖、博士生賴(lài)嘉健、博士后成涼和博士生詹恒基為本文共同第一作者。本研究得到了弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院李輝教授以及中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心黃林研究員的大力支持。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-71327-w

制版人：十一

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