如果你的課題涉及到腫瘤微環(huán)境、 CAR-T 或器官芯片，這篇 Nature 子刊能教你搞定所有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

最近有不少做免疫治療、器官芯片、腫瘤微環(huán)境的朋友私信小編，問(wèn)頂刊的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到底有什么門(mén)道。今天就帶大家深度解析一篇 2025 年 7 月發(fā)表在《Nature Biomedical Engineering》上的重磅研究 ——「Bioengineered immunocompetent preclinical trial-on-chip tool enables screening of CAR T cell therapy for leukaemia」（通訊作者：紐約大學(xué)陳偉強(qiáng)團(tuán)隊(duì)、賓夕法尼亞大學(xué) Saba Ghassemi 團(tuán)隊(duì)）。

這篇文章的設(shè)計(jì)思路可大致總結(jié)為：構(gòu)建仿生芯片模型 → 驗(yàn)證模型生理相關(guān)性 → 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) CAR-T 殺傷過(guò)程 → 解析微環(huán)境互作機(jī)制 → 模擬臨床反應(yīng)場(chǎng)景 → 篩選優(yōu)化 CAR-T 產(chǎn)品 → 個(gè)性化患者響應(yīng)預(yù)測(cè)。文章以實(shí)驗(yàn)為主，單細(xì)胞測(cè)序部分只做了驗(yàn)證性分析，但整體的工作量確實(shí)不�。�對(duì) CAR-T 療法、器官芯片、腫瘤免疫微環(huán)境方向感興趣的朋友，這篇文章的實(shí)驗(yàn)方法都可以參考，想設(shè)計(jì)其他思路的朋友也可以直接借鑒這套邏輯。分子互作和單細(xì)胞分析技術(shù)現(xiàn)在用得越來(lái)越多了，想在文章中加上這些技術(shù)的朋友也可以繼續(xù)往下看哦 ～

設(shè)計(jì)思路

1、通過(guò)構(gòu)建三維微流控芯片模型，模擬人白血病骨髓的解剖結(jié)構(gòu)和病理生理特征：

研究團(tuán)隊(duì)首先設(shè)計(jì)了一個(gè)三區(qū)域微流控芯片：中央竇區(qū)（血管化）、髓腔區(qū)（填充造血細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和白血病細(xì)胞）、骨內(nèi)膜區(qū)（成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）。芯片采用 PDMS 復(fù)制模塑法制備，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨髓單個(gè)核細(xì)胞和 Reh B-ALL 細(xì)胞按生理密度接種于纖維蛋白水凝膠中，培養(yǎng) 5-7 天誘導(dǎo)血管網(wǎng)絡(luò)自組裝。

2、通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序驗(yàn)證芯片模型的生理相關(guān)性：

為了驗(yàn)證工程化骨髓微環(huán)境與體內(nèi)真實(shí)情況的相似性，研究團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞 mRNA 測(cè)序技術(shù)，對(duì)比分析了芯片中收集的細(xì)胞樣本與新鮮骨髓單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞組成。測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了骨髓芯片在培養(yǎng) 9 天后仍維持了豐富的造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成，與體內(nèi)骨髓相當(dāng)。通過(guò)免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了髓系（CD14+單核細(xì)胞、CD68+巨噬細(xì)胞）和淋巴系（CD8+和 CD4+ T 細(xì)胞）細(xì)胞在芯片上的維持。

3、通過(guò)實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) CAR-T 細(xì)胞功能：

將 DiD 標(biāo)記的第二代抗 CD19 4-1BBζ-CAR T cells 細(xì)胞注入芯片中央竇，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光成像連續(xù)監(jiān)測(cè) 7 天。結(jié)果發(fā)現(xiàn) CAR-T 細(xì)胞在 3 天內(nèi)清除約 70% 的白血病細(xì)胞，7 天達(dá)到完全根除（>99%），而 Mock T 細(xì)胞或未處理組無(wú)法控制白血病進(jìn)展。研究還捕捉到了 CAR-T 細(xì)胞外滲、遷移、識(shí)別殺傷的全過(guò)程，量化了 CAR-T 細(xì)胞的遷移速度（1.213 μm/min）和運(yùn)動(dòng)軌跡。

4、通過(guò)流式、ELISA 和單細(xì)胞測(cè)序解析 CAR-T 細(xì)胞功能狀態(tài)：

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) T 細(xì)胞活化標(biāo)志物 CD25 和 CD69，ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子 IFNγ、顆粒酶 B、穿孔素的分泌，單細(xì)胞測(cè)序分析基因表達(dá)變化。結(jié)果證實(shí) CAR-T 細(xì)胞與 CD19+靶標(biāo)相互作用后顯著增強(qiáng)活化標(biāo)志物表達(dá)和細(xì)胞毒性相關(guān)細(xì)胞因子分泌，同時(shí)上調(diào) T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th1/Th2 細(xì)胞分化、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等信號(hào)通路。

5、通過(guò)免疫熒光和細(xì)胞因子譜分析解析 CAR-T 細(xì)胞與骨髓微環(huán)境的相互作用：

研究發(fā)現(xiàn) CAR-T 細(xì)胞處理誘導(dǎo)血管細(xì)胞表面 ICAM-1 表達(dá)增強(qiáng)（支持 T 細(xì)胞外滲），CD14+單核細(xì)胞表面 HLA-DR 表達(dá)增強(qiáng)（抗原提呈相關(guān)）。細(xì)胞因子譜分析顯示 CAR-T 細(xì)胞誘導(dǎo)了過(guò)度的細(xì)胞因子產(chǎn)生，如免疫刺激細(xì)胞因子 MIP-1β、趨化因子 RANTES、炎癥因子 MCP-2 等。單細(xì)胞測(cè)序分析證實(shí) CAR-T 細(xì)胞觸發(fā)了免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的系統(tǒng)性反應(yīng)，如干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族表達(dá)增強(qiáng)。

6、通過(guò)調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞比例、摻入抗原陰性克隆模擬臨床緩解、耐藥和復(fù)發(fā)場(chǎng)景：

為了復(fù)制臨床復(fù)發(fā)場(chǎng)景，研究團(tuán)隊(duì)在制備白血病芯片時(shí)向總白血病群體中摻入 5% 或 1% 的 CD19-白血病細(xì)胞；為了模擬耐藥場(chǎng)景，將每芯片 CAR-T 細(xì)胞數(shù)量降至 2,500 個(gè)（緩解場(chǎng)景為 10,000 個(gè)）。通過(guò)熒光成像連續(xù)監(jiān)測(cè) 14 天以上，發(fā)現(xiàn) 2,500 個(gè) CAR-T 細(xì)胞大多無(wú)法控制白血病進(jìn)展（耐藥），10,000 個(gè) CAR-T 細(xì)胞清除大部分 CD19+細(xì)胞但 CD19-細(xì)胞不受限制地?cái)U(kuò)增（復(fù)發(fā)），與臨床觀察到的動(dòng)態(tài)模式高度吻合。

7、通過(guò)對(duì)比不同 CAR 設(shè)計(jì)、不同培養(yǎng)時(shí)間、不同患者來(lái)源的 CAR-T 產(chǎn)品驗(yàn)證芯片的篩選能力：

研究比較了第二代 CAR（CD28ζ、ICOSζ、4-1BBζ）和第四代 CAR（4-1BBζ-IL18）的功能表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn) 4-1BBζ-CAR 分泌更多 IL-13（Th2 細(xì)胞因子），CD28ζ-CAR 和 ICOSζ-CAR 分泌更多 IL-10。對(duì)比培養(yǎng) 3 天和 9 天的 CAR-T 產(chǎn)品（D3-CAR 和 D9-CAR），發(fā)現(xiàn) D3-CAR 在低劑量時(shí)療效更優(yōu)，這與其增強(qiáng)的增殖能力（Ki67 高表達(dá)）和細(xì)胞因子分泌相關(guān)。測(cè)試 4 位患者來(lái)源的 CAR-T 產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)只有非 B-ALL 肺癌患者的 CAR-T 細(xì)胞（PD145）實(shí)現(xiàn)了芯片上的緩解。

8、通過(guò)構(gòu)建患者特異性芯片驗(yàn)證個(gè)性化 CAR-T 細(xì)胞響應(yīng)：

使用 3 位匹配的患者樣本（PD7606、PD7813、PD8012 骨髓單個(gè)核細(xì)胞構(gòu)建患者特異性芯片，匹配的 PD7607、PD7814、PD8009 外周血單個(gè)核細(xì)胞制備的 4-1BBζ-CAR T 細(xì)胞處理芯片），發(fā)現(xiàn)患者 CAR-T 細(xì)胞在匹配的白血病芯片中顯著清除白血病細(xì)胞，表面 CD69 表達(dá)增強(qiáng)，IFNγ 和其他細(xì)胞毒性細(xì)胞因子顯著高于 Mock T 細(xì)胞處理組。

主要結(jié)果

1、成功構(gòu)建了具有生理相關(guān)性的免疫活性人白血病骨髓芯片：

通過(guò)三區(qū)域微流控芯片設(shè)計(jì)，結(jié)合多種原代細(xì)胞共培養(yǎng)，成功在體外重建了人白血病骨髓的微結(jié)構(gòu)和病理生理特征。單細(xì)胞測(cè)序和免疫熒光驗(yàn)證了芯片中造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的多樣性維持，血管網(wǎng)絡(luò)自組裝形成，ECM（層粘連蛋白、纖連蛋白、IV 型膠原）沉積重塑，與體內(nèi)骨髓高度相似。

圖 1: 直觀展示了這一工程化骨髓芯片的設(shè)計(jì)思路和構(gòu)建結(jié)果

2、CAR-T 細(xì)胞在芯片上實(shí)現(xiàn)了對(duì)白血病的有效清除并表現(xiàn)出特征性功能狀態(tài)：

CAR-T 細(xì)胞在 7 天內(nèi)完全清除白血病細(xì)胞（>99% 殺傷），實(shí)時(shí)成像捕捉到 CAR-T 細(xì)胞外滲、遷移、識(shí)別殺傷的全過(guò)程。CAR-T 細(xì)胞在與靶標(biāo)相互作用后顯著增強(qiáng)活化標(biāo)志物（CD25、CD69）表達(dá)，細(xì)胞毒性相關(guān)細(xì)胞因子（IFNγ、顆粒酶 B、穿孔素）分泌，上調(diào) T 細(xì)胞受體信號(hào)通路和免疫反應(yīng)相關(guān)通路。

3、CAR-T 細(xì)胞觸發(fā)了骨髓微環(huán)境的系統(tǒng)性免疫反應(yīng)：

CAR-T 細(xì)胞處理誘導(dǎo)血管細(xì)胞 ICAM-1 表達(dá)增強(qiáng)（促進(jìn) T 細(xì)胞外滲），單核細(xì)胞 HLA-DR 表達(dá)增強(qiáng)（促進(jìn)抗原提呈），并誘導(dǎo)過(guò)度的細(xì)胞因子產(chǎn)生（MIP-1β、RANTES、MCP-2 等）。單細(xì)胞測(cè)序證實(shí) CAR-T 細(xì)胞觸發(fā)了免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的系統(tǒng)性轉(zhuǎn)錄變化，如干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族表達(dá)增強(qiáng)。

4、芯片成功模擬了臨床緩解、耐藥和復(fù)發(fā)三種主要反應(yīng)場(chǎng)景：

通過(guò)調(diào)節(jié) CAR-T 細(xì)胞劑量（緩解：10,000/芯片；耐藥：2,500/芯片）和摻入 CD19-細(xì)胞（復(fù)發(fā)：5% 或 1% CD19-細(xì)胞），芯片重現(xiàn)了臨床觀察到的三種主要反應(yīng)模式。耐藥場(chǎng)景中 CAR-T 細(xì)胞分布范圍受限，復(fù)發(fā)場(chǎng)景中 CD19-細(xì)胞不受限制地?cái)U(kuò)增，與 209 例患者的臨床數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)模式高度吻合。

5、芯片能夠區(qū)分不同 CAR 設(shè)計(jì)和不同培養(yǎng)時(shí)間的 CAR-T 產(chǎn)品功能差異：

第二代 CAR 中，4-1BBζ-CAR 分泌更多 IL-13（Th2 細(xì)胞因子），CD28ζ-CAR 和 ICOSζ-CAR 分泌更多 IL-10。D3-CAR（培養(yǎng) 3 天）在低劑量時(shí)療效優(yōu)于 D9-CAR（培養(yǎng) 9 天），這與 D3-CAR 增強(qiáng)的增殖能力（Ki67 高表達(dá)）和細(xì)胞因子分泌相關(guān)。第四代 CAR（4-1BBζ-IL18）在功能表現(xiàn)上優(yōu)于第二代 CAR。

6、芯片能夠評(píng)估患者來(lái)源 CAR-T 細(xì)胞的功能差異并預(yù)測(cè)個(gè)性化響應(yīng)：

4 位患者來(lái)源的 CAR-T 細(xì)胞中，只有非 B-ALL 肺癌患者的 PD145 CAR-T 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了芯片上的緩解，其他 B-ALL 患者的 CAR-T 細(xì)胞功能明顯減弱。3 位匹配的患者樣本驗(yàn)證了患者 CAR-T 細(xì)胞在自體白血病芯片中的特異性激活和殺傷效應(yīng)，不同患者的 CAR-T 細(xì)胞功能差異顯著。

7、芯片為 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的臨床前評(píng)估提供了多維度的功能指數(shù)：

基于 T 細(xì)胞活化、增殖、遷移、細(xì)胞因子分泌等多個(gè)參數(shù)，研究建立了 CAR-T 細(xì)胞功能指數(shù)評(píng)估體系，能夠系統(tǒng)比較不同 CAR-T 產(chǎn)品的功能表現(xiàn)，為優(yōu)化 CAR-T 細(xì)胞制造和篩選提供了可靠的工具。

小編建議：

從圖片數(shù)量就能看出這篇文章的工作量，從模型構(gòu)建到生理驗(yàn)證，從動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)到機(jī)制解析，從臨床場(chǎng)景模擬到產(chǎn)品篩選優(yōu)化，從健康供體到患者來(lái)源樣本，層層遞進(jìn)，想進(jìn)軍 Nature 子刊的就照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)設(shè)計(jì)。

這篇文章最值得借鑒的是它的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)邏輯：先是用單細(xì)胞測(cè)序和真實(shí)人體數(shù)據(jù)比對(duì)，嚴(yán)謹(jǐn)驗(yàn)證生理相關(guān)性。然后講清楚了 CAR-T 細(xì)胞怎么進(jìn)去、怎么找、怎么殺。從「觀察」到「機(jī)制」再到「應(yīng)用」，觀察到現(xiàn)象（CAR-T 殺傷）→ 解析機(jī)制（微環(huán)境 ICAM-1、HLA-DR、細(xì)胞因子變化）→ 功能應(yīng)用（模擬臨床場(chǎng)景、篩選優(yōu)化產(chǎn)品），形成邏輯閉環(huán)。最后用臨床場(chǎng)景檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢r(jià)值，并用患者樣本驗(yàn)證。

沒(méi)時(shí)間設(shè)計(jì)思路或者不會(huì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的朋友可以多琢磨這套邏輯。

文獻(xiàn)鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-025-01428-2

參考文獻(xiàn)：Ma C, Wang H, Liu L, Chen R, Mukherjee N, Tong J, Kazmi S, Fang X, Witkowski MT, Aifantis I, Ghassemi S, Chen W. Bioengineered immunocompetent preclinical trial-on-chip tool enables screening of CAR T cell therapy for leukaemia. Nat Biomed Eng. 2025 Dec;9(12):2098-2114.

題圖：自制

編輯：冷漠小 z