【寫在前面】：本期推薦的是由成都中醫(yī)藥大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所等研究團(tuán)隊(duì)合作近期發(fā)表于International Immunopharmacology(IF4.7）的一篇文章，揭示冬凌草乙素通過(guò)雙重抑制RIPK1介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡改善阿爾茨海默病。

【期刊簡(jiǎn)介】

【題目及作者信息】

Ponicidin ameliorates Alzheimer's disease through dual inhibition of RIPK1-mediated neuroinflammation and necroptosis

冬凌草乙素是從冬凌草中分離得到的一種二萜類化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎作用。然而，其在阿爾茨海默病中的治療潛力，特別是在調(diào)控受體相互作用蛋白激酶1介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡方面的作用，尚未得到充分探索。本研究旨在探討冬凌草乙素靶向RIPK1以緩解AD發(fā)病機(jī)制的途徑。通過(guò)生物膜層干涉技術(shù)和藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了冬凌草乙素與RIPK1之間的相互作用。在體外，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)印跡法和流式細(xì)胞術(shù)，評(píng)估了冬凌草乙素對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞和HT22海馬神經(jīng)元細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及壞死性凋亡的影響。在體內(nèi)，通過(guò)對(duì)5×FAD轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試、組織學(xué)分析和生化檢測(cè)，評(píng)估了冬凌草乙素的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草乙素能以高親和力與RIPK1結(jié)合，并增強(qiáng)RIPK1對(duì)蛋白水解降解的抵抗能力。在小膠質(zhì)細(xì)胞中，冬凌草乙素通過(guò)破壞RIPK1-JAK1-STAT1信號(hào)通路，有效抑制了促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的釋放。在神經(jīng)元中，冬凌草乙素通過(guò)阻斷RIPK1-RIPK3-MLKL級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制了RIPK1介導(dǎo)的壞死性凋亡。對(duì)5×FAD小鼠的行為學(xué)分析表明，冬凌草乙素治療能顯著改善認(rèn)知功能，減少腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白斑塊沉積，并減輕神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡。冬凌草乙素通過(guò)靶向RIPK1，對(duì)AD中兩個(gè)關(guān)鍵的病理過(guò)程——神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡——產(chǎn)生雙重神經(jīng)保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了冬凌草乙素作為AD疾病修飾療法的潛力，并為天然產(chǎn)物來(lái)源的RIPK1抑制劑在神經(jīng)退行性疾病中的臨床開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

【前言】

阿爾茨海默?。ˋD）是一種進(jìn)行性、致殘性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶喪失、認(rèn)知功能障礙和行為異常。AD的標(biāo)志性病理特征包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊沉積和由Tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，這些經(jīng)典病理的發(fā)生和發(fā)展并非僅由蛋白質(zhì)聚集引起，而與神經(jīng)炎癥的慢性激活和神經(jīng)元死亡密切相關(guān)。目前AD的標(biāo)準(zhǔn)治療主要包括膽堿酯酶抑制劑（如多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏）和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑（如美金剛）。雖然這些療法能夠緩解癥狀，但無(wú)法阻止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展。近年來(lái)，抗Aβ單克隆抗體（如侖卡奈單抗和多奈單抗）作為疾病修飾療法顯示出一定潛力。然而，其臨床應(yīng)用受限于高昂的成本、復(fù)雜的給藥方案以及腦水腫和出血等安全性問(wèn)題，且其神經(jīng)保護(hù)作用相對(duì)有限。因此，迫切需要探索新的病理機(jī)制和分子靶點(diǎn)，以開發(fā)更安全、更有效的AD治療策略。

慢性神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放一系列促炎細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）。這些細(xì)胞因子通過(guò)JAK1/STAT1通路傳遞炎癥信號(hào)，誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄并放大炎癥反應(yīng)。在AD患者和動(dòng)物模型中，JAK1/STAT1通路常被過(guò)度激活，特別是STAT1磷酸化水平升高，從而維持膠質(zhì)細(xì)胞的促炎表型，加劇神經(jīng)炎癥。抑制JAK1/STAT1信號(hào)已被證明可以減輕膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，促進(jìn)Aβ清除，并改善突觸功能和認(rèn)知缺陷。重要的是，受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）已成為這一炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵上游分子，作為細(xì)胞死亡和炎癥信號(hào)交匯點(diǎn)的核心調(diào)控因子。在AD小膠質(zhì)細(xì)胞中，異常的RIPK1激活促進(jìn)了促炎細(xì)胞因子的釋放，并通過(guò)JAK1/STAT1信號(hào)放大炎癥，形成神經(jīng)炎癥的惡性循環(huán)。

除了炎癥，壞死性凋亡——一種受調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡形式——已被認(rèn)為是導(dǎo)致AD神經(jīng)元丟失的主要機(jī)制。該過(guò)程由死亡受體信號(hào)（如TNF-α/TNFR1）觸發(fā)，并依賴于RIPK1激酶活性：當(dāng)?shù)蛲霰蛔钄鄷r(shí)，RIPK1與RIPK3相互作用并募集MLKL，形成壞死小體復(fù)合物，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)容物釋放。與凋亡不同，壞死性凋亡會(huì)釋放大量損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），進(jìn)一步加劇炎癥。研究表明，在AD患者大腦中，RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平顯著升高，且與磷酸化Tau蛋白的積累以及Braak分期進(jìn)展相關(guān)。此外，RIPK1水平與腦重量和認(rèn)知功能呈負(fù)相關(guān)，表明其異常激活加速了神經(jīng)元丟失。在臨床前模型中，Aβ寡聚體負(fù)荷的增加與pMLKL表達(dá)升高有關(guān)，并且通過(guò)基因或藥理學(xué)方法抑制壞死性凋亡均能有效緩解Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元變性和認(rèn)知障礙。此外，由Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的TNF-α可通過(guò)TNF/RIPK1軸誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死性凋亡，阻斷該通路能有效防止神經(jīng)元損傷。這些發(fā)現(xiàn)突顯了AD中炎癥與壞死性凋亡的相互促進(jìn)關(guān)系，而RIPK1則充當(dāng)了二者的關(guān)鍵樞紐。動(dòng)物模型研究進(jìn)一步支持了抑制RIPK1激酶活性可顯著減輕炎癥、保護(hù)神經(jīng)元并改善AD樣病理和認(rèn)知功能的觀點(diǎn)。目前已有數(shù)種小分子RIPK1抑制劑進(jìn)入臨床開發(fā)階段，其中包括可滲透腦屏障的抑制劑SAR443060（DNL747），該藥已進(jìn)入針對(duì)AD患者的II期臨床試驗(yàn)。這些進(jìn)展凸顯了RIPK1作為AD治療的一個(gè)有前景的靶點(diǎn)。

傳統(tǒng)草藥為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了豐富但尚未被充分利用的生物活性化合物資源。在東亞草藥中，冬凌草（Rabdosia rubescens）素有治療炎癥性疾病的歷史。該植物的藥理作用歸因于多種植物化學(xué)物質(zhì)，包括二萜、三萜、生物堿、黃酮類和多糖。冬凌草乙素（Pon）是從冬凌草中分離得到的一種對(duì)映-貝殼杉烷型二萜化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、神經(jīng)保護(hù)和抗腫瘤作用。在糖尿病并發(fā)癥模型中，Pon下調(diào)IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子，同時(shí)上調(diào)IL-4和IL-10，從而改善炎癥狀態(tài)。在神經(jīng)元中，Pon減輕了Aβ1-42誘導(dǎo)的損傷，并通過(guò)激活SIRT1-PI3K/Akt通路發(fā)揮保護(hù)作用。此外，Pon在各種疾病模型中顯示出抗氧化和抗凋亡活性，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯和程序性細(xì)胞死亡，突顯了其多靶點(diǎn)藥理潛力。盡管其藥理特性前景廣闊，但Pon在AD模型中的體內(nèi)效應(yīng)及其對(duì)壞死性凋亡的影響此前尚未明確。本研究表明，Pon直接靶向RIPK1，減弱小膠質(zhì)細(xì)胞中RIPK1-JAK1-STAT1炎癥通路，并阻斷神經(jīng)元中RIPK1-RIPK3-MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡，從而顯著改善5×FAD小鼠模型的認(rèn)知缺陷。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了Pon先前未被認(rèn)識(shí)的機(jī)制，并通過(guò)確定RIPK1為其直接靶點(diǎn)填補(bǔ)了天然產(chǎn)物藥理學(xué)中的一個(gè)關(guān)鍵空白，而且為理解AD的潛在病理過(guò)程提供了新見(jiàn)解。

【結(jié)果部分】

1. 冬凌草乙素的直接分子靶點(diǎn)：RIPK1。

圖1 冬凌草乙素抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生并靶向RIPK1。(A) 冬凌草乙素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這是一種從冬凌草中分離得到的天然二萜化合物。(B–C) RT-qPCR分析顯示冬凌草乙素在BV2細(xì)胞中抑制促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞先用冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預(yù)處理30分鐘，再用LZ刺激4小時(shí)。Tnf-α和Il-6的相對(duì)mRNA表達(dá)水平經(jīng)Gapdh歸一化后進(jìn)行定量。(D–E) ELISA結(jié)果顯示冬凌草乙素減少LZ誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌。BV2細(xì)胞先用冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預(yù)處理30分鐘，再用LZ刺激8小時(shí)。測(cè)定上清液中IL-6和TNF-α的水平。(F) BV2細(xì)胞以每孔1.2 × 10?個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)18小時(shí)。進(jìn)行冬凌草乙素處理時(shí)，從100 μM開始進(jìn)行系列稀釋，直至1.56 μM（共8個(gè)濃度）。處理8小時(shí)后，使用CCK-8法評(píng)估細(xì)胞活力。測(cè)得冬凌草乙素的CC50為59.360 ± 3.58 μM。(G) BLI分析顯示冬凌草乙素與RIPK1的結(jié)合相互作用，解離常數(shù)KD為135 nM。(H) DARTS實(shí)驗(yàn)證明冬凌草乙素增強(qiáng)了HT22細(xì)胞中RIPK1對(duì)蛋白水解降解的抵抗能力。細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)18小時(shí)后進(jìn)行DARTS實(shí)驗(yàn)。

2.冬凌草乙素經(jīng)由RIPK1–JAK1–STAT1軸緩解小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥。

圖2 冬凌草乙素通過(guò)抑制RIPK1–JAK1–STAT1信號(hào)軸減輕神經(jīng)炎癥。 (A-B) BV2細(xì)胞用遞增濃度的冬凌草乙素處理，隨后用LZ刺激8小時(shí)。通過(guò)ELISA測(cè)定IL-6和TNF-α水平，計(jì)算抑制率并確定半抑制濃度。(C–K) 冬凌草乙素（5 μM）與Nec-1（10 μM）抑制BV2細(xì)胞中LZ誘導(dǎo)的RIPK1、JAK1和STAT1磷酸化。細(xì)胞經(jīng)冬凌草乙素或Nec-1處理30分鐘后，用LZ刺激4小時(shí)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析蛋白水平，以Actin作為內(nèi)參蛋白。

3.冬凌草乙素通過(guò)抑制RIPK1–RIPK3–MLKL級(jí)聯(lián)反應(yīng)阻斷神經(jīng)元壞死性凋亡。

圖3 冬凌草乙素通過(guò)阻斷RIPK1–RIPK3–MLKL信號(hào)通路抑制神經(jīng)元壞死性凋亡。(A) BV2細(xì)胞以每孔1.2 × 10?個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)18小時(shí)。使用冬凌草乙素處理時(shí)，從100 μM開始進(jìn)行倍比系列稀釋至1.56 μM（共8個(gè)濃度）。處理8小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，測(cè)得其CC50為29.50 ± 0.204 μM。(B) 在經(jīng)冬凌草乙素（5 μM）預(yù)處理30分鐘、隨后用TZ刺激的HT22神經(jīng)元中進(jìn)行LDH釋放的時(shí)序測(cè)定。(C) 對(duì)Hoechst（藍(lán)色，細(xì)胞核染色）和PI（紅色，死細(xì)胞標(biāo)記物）染色的HT22細(xì)胞進(jìn)行高內(nèi)涵成像分析。HT22神經(jīng)元經(jīng)冬凌草乙素（5 μM）或Nec-1（10 μM）預(yù)處理30分鐘后，用TZ刺激8小時(shí)?！癕erge”圖像為Hoechst與PI染色的疊加。(D) 各組細(xì)胞死亡百分比的定量分析。(E) 流式細(xì)胞術(shù)分析經(jīng)冬凌草乙素或Nec-1預(yù)處理30分鐘、隨后用TZ刺激8小時(shí)的HT22神經(jīng)元的壞死性凋亡情況。壞死細(xì)胞在Q2象限進(jìn)行定量。(F) 流式細(xì)胞術(shù)Q2象限的定量分析。(G-M) 冬凌草乙素和Nec-1抑制RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。細(xì)胞經(jīng)冬凌草乙素或Nec-1處理30分鐘后，用TZ刺激4小時(shí)。

4.冬凌草乙素通過(guò)抑制RIPK1緩解炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死性凋亡。

圖4 冬凌草乙素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的HT22神經(jīng)元壞死性凋亡。(A) 采用高內(nèi)涵成像分析HT22細(xì)胞經(jīng)BV2細(xì)胞上清液刺激8小時(shí)后的情況（實(shí)驗(yàn)方法詳見(jiàn)第2.4節(jié)）。HT22細(xì)胞經(jīng)Hoechst（藍(lán)色，細(xì)胞核染色）與PI（紅色，死細(xì)胞標(biāo)記物）染色，“Merge”圖像顯示Hoechst與PI染色的疊加。(B) 各組細(xì)胞死亡百分比的定量分析。(C) LDH檢測(cè)表明，冬凌草乙素與Nec-1均能顯著降低BV2-LZ-su誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞毒性。(D) 將TNF-α抗體與HT22神經(jīng)元預(yù)孵育后，再用BV2-LZ-su處理?；罴?xì)胞比例分析顯示，TNF-α是HT22細(xì)胞中壞死性凋亡的主要介導(dǎo)因子。(E-K) 蛋白質(zhì)印跡分析表明，冬凌草乙素或Nec-1處理能減弱BV2-LZ-su刺激的HT22細(xì)胞中RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。

5.冬凌草乙素通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥與壞死性凋亡改善5×FAD小鼠的認(rèn)知缺陷。

圖5 冬凌草乙素改善5×FAD轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能。 (A) T迷宮實(shí)驗(yàn)示意圖。(B–D) T迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經(jīng)冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠在探索新臂時(shí)行進(jìn)距離更長(zhǎng)、進(jìn)入新臂次數(shù)更多、探索新臂的潛伏期更短。(E) Y迷宮實(shí)驗(yàn)示意圖。(F–H) Y迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與未處理的5×FAD小鼠相比，冬凌草乙素（10 mg/kg）和Nec-1（10 mg/kg）處理使5×FAD小鼠探索新臂的行進(jìn)距離更長(zhǎng)、進(jìn)入新臂次數(shù)更多、探索新臂的潛伏期更短。

圖6 冬凌草乙素改善5×FAD轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力。(A) 巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)示意圖。(B–D) 巴恩斯迷宮結(jié)果顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經(jīng)冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠表現(xiàn)出更短的目標(biāo)區(qū)潛伏期、更少的目標(biāo)區(qū)錯(cuò)誤次數(shù)以及更低的目標(biāo)區(qū)偏離度。(E) 探索試驗(yàn)期間的代表性游泳軌跡。(F) 第5天的莫里斯水迷宮探索試驗(yàn)顯示，與未處理的5×FAD小鼠相比，經(jīng)冬凌草乙素（10 mg/kg）或Nec-1（10 mg/kg）處理的5×FAD小鼠在平臺(tái)區(qū)域停留時(shí)間更長(zhǎng)。

圖7 冬凌草乙素治療減少5×FAD小鼠的Aβ斑塊沉積并減輕神經(jīng)炎癥與壞死性凋亡。(A–L) 腦組織蛋白質(zhì)印跡分析顯示，冬凌草乙素治療降低了APP的表達(dá)，減少了JAK1-STAT1通路標(biāo)記物（pJAK1與pSTAT1）以及促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平。同時(shí)，冬凌草乙素通過(guò)降低RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化緩解了壞死性凋亡。以Actin作為內(nèi)參蛋白。(M) 免疫組織化學(xué)分析表明，冬凌草乙素（10 mg/kg）和Nec-1（10 mg/kg）有效減少了5×FAD小鼠海馬和皮層中的Aβ斑塊沉積。

6. 冬凌草乙素雙重保護(hù)機(jī)制示意圖。

圖8 冬凌草乙素雙重保護(hù)機(jī)制示意圖。在阿爾茨海默病小鼠模型中，冬凌草乙素通過(guò)抑制RIPK1–JAK1–STAT1信號(hào)軸，減少小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α等神經(jīng)炎癥因子，從而緩解神經(jīng)炎癥；同時(shí)，冬凌草乙素阻斷RIPK1–RIPK3–MLKL信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制神經(jīng)元壞死性凋亡。

【結(jié)論與討論】

冬凌草乙素通過(guò)靶向RIPK1，對(duì)AD中兩個(gè)關(guān)鍵的病理過(guò)程—神經(jīng)炎癥和壞死性凋亡—產(chǎn)生雙重神經(jīng)保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了冬凌草乙素作為AD疾病修飾療法的潛力，并為天然產(chǎn)物來(lái)源的RIPK1抑制劑在神經(jīng)退行性疾病中的臨床開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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