VOL 3742

與單基因突變相關(guān)的自閉癥治療，有可能進(jìn)入快車道。

2026年1月27日，國(guó)際頂級(jí)期刊《細(xì)胞》（Cell）雜志在線發(fā)表中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院路中華教授團(tuán)隊(duì)的最新研究成果。

該團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)第一醫(yī)院合作，開發(fā)了帶有易位連接的腺相關(guān)病毒（AAVLINK），使穩(wěn)定、高效的大基因遞送成為可能。

腺相關(guān)病毒（AAV）是目前基因治療中最常見的基因遞送載體，但受限于其有限的包裝容量（極限容量約為 4.7kb 至 5.0kb），目前已知的自閉癥風(fēng)險(xiǎn)基因中，有 37.5% 的基因都大到無法用單個(gè) AAV 運(yùn)送。

路中華團(tuán)隊(duì)開發(fā)的AAVLINK及其迭代版本AAVLINK2.0，利用一種叫作“ Cre/lox 介導(dǎo)的分子間 DNA 重組“技術(shù)，將大基因拆分為2-3段，用2-3個(gè)AAV同時(shí)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)后重組，從而突破單個(gè)AAV容量不足的問題。

利用該技術(shù)，路中華團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)涵蓋193 個(gè)與遺傳性疾病相關(guān)的大基因、五種基于 CRISPR 的基因工具的載體庫(kù)，其中166個(gè)是與自閉癥相關(guān)的基因，包括SHANK3、CHD8、SYNGAP1、SCN1A等。

其中，SHANK3（費(fèi)蘭-麥克德米德綜合征）、 SCN1A（Dravet 綜合征）等已在試驗(yàn)階段的基因療法，有可能因此縮短臨床應(yīng)用的時(shí)間。

文 | 譚萬能

AAVLINK方案示意圖、迭代過程、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果、198個(gè)基因庫(kù)和5個(gè)可遞送的基因編輯工具（圖源：doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039）

一個(gè)高效、穩(wěn)定、安全的基因“快遞”系統(tǒng)的誕生

如果把基因治療中的基因遞送比作一次“送快遞”，那么腺相關(guān)病毒（AAV）無疑是目前生物醫(yī)藥界公認(rèn)的金牌快遞員。它安全、不致病，還能長(zhǎng)期駐留在細(xì)胞里工作。

但這位金牌快遞員有一個(gè)致命的弱點(diǎn)：它的“隨身行李箱”太小了。

AAV 是一種非常微小的病毒，它的衣殼空間決定了其裝載基因的極限容量約為 4.7kb 至 5.0kb。但許多重大的遺傳性疾病，其致病基因都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過這個(gè)荷載：

● 杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）：其所需的抗肌萎縮蛋白基因長(zhǎng)達(dá) 14kb，是 AAV 容量的近 3 倍。

● Dravet 綜合征（嬰兒嚴(yán)重癲癇）：所需的 SCN1A 鈉通道基因達(dá)到 6kb。

● 自閉癥譜系障礙（ASD）：統(tǒng)計(jì)顯示，在 ASD 風(fēng)險(xiǎn)基因中，有 37.5% 的基因都大到無法用單個(gè) AAV 運(yùn)送。

為了把這些大基因遞送到目標(biāo)細(xì)胞，科學(xué)家想了很多辦法，比如蛋白質(zhì)反式剪接 （Intein）、RNA 反式剪接 （StitchR） 以及傳統(tǒng) DNA 重組 （tsAAV）。

但這些方法在DNA拆分位點(diǎn)選擇的靈活性、復(fù)原的效率、產(chǎn)物的純凈度等方面，都或多或少的存在不足。

為克服這些缺陷，路中華團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為AAVLINK（AAV 易位銜接）的新策略。

它借鑒了類似“宜家家具”的運(yùn)輸哲學(xué)，將一個(gè)大基因拆分為兩個(gè)（雙載體）甚至三個(gè)（三載體）較小的片段，分別裝入不同的 AAV“快遞箱”中。

但這也帶來了一個(gè)新的技術(shù)挑戰(zhàn)：如何在細(xì)胞核這個(gè)微觀的“房間”里，把拆散的基因嚴(yán)絲合縫地拼回去？

AAVLINK 利用 Cre/lox 介導(dǎo)的分子間 DNA 重組技術(shù)，通過重組酶（Cre）去識(shí)別并操作特定的識(shí)別位點(diǎn)（loxP），從而實(shí)現(xiàn)對(duì) DNA 片段的精準(zhǔn)剪切、倒置或易位連接。

AAVLINK流程示意圖（圖源：http://aavlink.com/）

具體步驟如下：

1. 分頭入戶：攜帶不同基因片段的 AAV 同時(shí)感染同一個(gè)細(xì)胞。

2. 召喚焊工：載體中攜帶的Cre重組酶，像一個(gè)精準(zhǔn)的焊接工，能識(shí)別 DNA 兩端的特定接口（lox位點(diǎn)），將兩段分離的 DNA 物理連接在一起。

3. 無痕精修：焊接完成后，DNA 上會(huì)留下一段多余的接口痕跡（人工內(nèi)含子）。此時(shí)，細(xì)胞自帶的“剪接系統(tǒng)”會(huì)像裝修工一樣，把這段多余痕跡切除，最終在 mRNA 水平上復(fù)原出全長(zhǎng)基因。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，這種 DNA 維度的重組效率極高。在修復(fù)自閉癥相關(guān)的 Shank3基因時(shí)，AAVLINK 的效率比現(xiàn)有的蛋白質(zhì)拼接技術(shù)（Intein）高出了 36.6 倍。

為了防止Cre重組酶在完成基因重組后還駐留在細(xì)胞內(nèi)，并錯(cuò)誤地切割人體自身的基因組（偽位點(diǎn)效應(yīng)），路中華團(tuán)隊(duì)在驗(yàn)證了AAVLINK方案的可行性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，對(duì)它的安全性進(jìn)行了升級(jí)。

AAVLINK的迭代過程（圖源：http://aavlink.com/）

在升級(jí)版的 AAVLINK 2.0 版本中，研發(fā)團(tuán)隊(duì)為 Cre 設(shè)計(jì)了“任務(wù)完成即自毀”的三重保險(xiǎn)：

●第一重：斷電（表達(dá)自終止）。基因重組一旦完成，Cre 的基因編碼區(qū)就會(huì)自動(dòng)與供能元件（PolyA）斷開，使其無法繼續(xù)產(chǎn)生新的酶。

●第二重：靜音（超弱啟動(dòng)子）。放棄強(qiáng)啟動(dòng)子，改用超弱啟動(dòng)子 SCP1。這就像讓安裝工“悄悄進(jìn)村”，只產(chǎn)生剛好夠用的微量酶，絕不驚動(dòng)免疫系統(tǒng)。

●第三重：銷毀（降解標(biāo)簽）。這是最核心的改進(jìn)?？茖W(xué)家給 Cre 貼上了一個(gè)“垃圾標(biāo)簽”（UDeg3a）。細(xì)胞內(nèi)的清潔工（蛋白酶體）一看到這個(gè)標(biāo)簽，就會(huì)在 Cre 完成工作后迅速將其降解銷毀。

結(jié)果顯示，在 2.0 版本中，重組發(fā)生后 Cre 的殘留水平低于檢測(cè)限。

166個(gè)自閉癥基因的“拆裝”方案

為了驗(yàn)證這一技術(shù)的可行性，路中華團(tuán)隊(duì)針對(duì)兩種難治性遺傳病進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1. 費(fèi)蘭-麥克德米德綜合征（PMS）

費(fèi)蘭-麥克德米德綜合征（PMS）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育疾病，由 SHANK3 基因缺失引起（該基因長(zhǎng) 5.4kb，超載）。

利用 AAVLINK 將其拆分遞送入小鼠腦部后，不僅恢復(fù)了關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，小鼠的重復(fù)刻板行為（如不停理毛）也消失了，社交功能得到恢復(fù)。

SHANK3是最早有基因治療方案的自閉癥風(fēng)險(xiǎn)基因，其核心專利的持有者馮國(guó)平教授也是路中華留學(xué)杜克大學(xué)時(shí)的博士生導(dǎo)師。AAVLINK方案的面世，或?qū)⒓铀貾MS基因療法的落地。

2. Dravet 綜合征

Dravet 綜合征是一種致死率極高的嬰兒期癲癇，致病基因 SCN1A 長(zhǎng)達(dá) 6.0kb。在實(shí)驗(yàn)中，未治療的患病小鼠生存率不足 50%。

而經(jīng)過 AAVLINK 全身治療后，小鼠的生存率飆升至近 90%，神經(jīng)元放電功能恢復(fù)正常。

包括上述兩個(gè)基因在內(nèi)，路中華團(tuán)隊(duì)從 SFARI Gene 數(shù)據(jù)庫(kù)（全球最權(quán)威的自閉癥基因數(shù)據(jù)庫(kù)）中篩選了166符合以下三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的基因，并構(gòu)建了”運(yùn)輸“和”拆裝“方案：

●單基因致病性：絕大多數(shù)單基因自閉癥是由功能缺失（Loss-of-Function, LoF）或單倍體不足（Haploinsufficiency）引起的 。這意味著只要這個(gè)特定基因的一個(gè)副本壞了，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不夠用，就會(huì)導(dǎo)致疾病。

●大片段限制：編碼序列（CDS）長(zhǎng)度超過 4 kb 。這類基因以往無法裝入單個(gè) AAV（約 4.7 kb 上限），因此是基因治療的“處女地”。

●臨床適用性：適合通過“基因替代（Gene Replacement）”療法進(jìn)行修復(fù)，即通過 AAVLINK 送入一個(gè)正常的基因副本 。

198個(gè)基因“拆裝”方案及效果驗(yàn)證（圖源：doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039）

具體包括SFARI三個(gè)得分等級(jí)，即Score 1-3的基因。比如極高置信度（SFARI Score 1）里的：

●SHANK3：導(dǎo)致費(fèi)蘭-麥克德米德綜合征（PMS）的核心基因。它是突觸后致密區(qū)的關(guān)鍵支架蛋白，其缺失是單基因自閉癥最典型的代表之一 。

●CHD8：一種染色質(zhì)重塑因子。CHD8 突變被認(rèn)為是自閉癥中最常見的單基因致病因素之一。

●SYNGAP1：編碼一種在突觸中調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性的酶，缺失會(huì)導(dǎo)致智力障礙和自閉癥 。

●SCN1A：導(dǎo)致Dravet 綜合征（嬰兒嚴(yán)重癲癇）的核心基因。

●SCN2A：編碼鈉通道蛋白。其功能缺失突變通常與自閉癥和發(fā)育遲緩相關(guān) 。

●RAI1：導(dǎo)致史密斯-馬吉利綜合征（Smith-Magenis Syndrome），患兒表現(xiàn)出明顯的自閉癥行為特征 。

●CACNA1C：與 Timothy 綜合征相關(guān)，該綜合征有極高比例的患兒被診斷為自閉癥 。

自閉癥基因治療的新時(shí)代來臨？

除了直接將大基因遞送到細(xì)胞內(nèi)以外，AAVLINK也支持將基因編輯工具的直接遞送。例如高精度的堿基編輯器（BE）和先導(dǎo)編輯器（PE），它們的體積通常在 5kb 到 6.5kb 之間，以前的單個(gè)AAV也根本拉不動(dòng)。

有的時(shí)候，為了能夠讓AAV將編輯器運(yùn)到細(xì)胞中，研究人員還不得不針對(duì)編輯器進(jìn)行專門設(shè)計(jì)。比如我們之前報(bào)道的仇子龍教授團(tuán)隊(duì)針對(duì)MEF2C基因的基因編輯治療，就采用類似的方法。

AAVLINK 2.0 系統(tǒng)成功復(fù)原了大型堿基編輯器 ABE8e 和 YE1-BE4max 。

在針對(duì)高血脂癥靶點(diǎn) Pcsk9 的實(shí)驗(yàn)中，AAVLINK-ABE8e 在小鼠體內(nèi)的 A-to-G 編輯率達(dá)到了驚人的 16%，并顯著降低了血液中的 PCSK9 蛋白水平。

同時(shí)，AAVLINK 的出現(xiàn)，也使得標(biāo)準(zhǔn)的 SpCas9 工具完整遞送成為可能。

通過雙載體拆分 SpCas9（切點(diǎn)于 c.2682），使得兩枚載體可以各自攜帶強(qiáng)大的啟動(dòng)子和多條 sgRNA 。

實(shí)驗(yàn)證明，重組后的 SpCas9 在小鼠肝臟中實(shí)現(xiàn)了對(duì) Rosa26 位點(diǎn)的精準(zhǔn)切割，成功率與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染水平相當(dāng) 。

AAVLINK目前支持SpCas9, ABE8e, YE1-BE4max，dCas9-VPH和CRISPRoff這五個(gè)基因編輯工具的遞送，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)突變的修復(fù)。

目前，包括166個(gè)自閉癥基因在內(nèi)的198個(gè)基因和5個(gè)基因編輯工具，均可在團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的名為 AAVLINK Resource （http://aavlink.com/）的網(wǎng)站查詢具體“拆裝方案”，涵蓋自閉癥、肌肉萎縮癥、耳聾等多個(gè)領(lǐng)域。

需要提醒讀者的是，雖然該技術(shù)的出現(xiàn)可能加快自閉癥基因治療的步伐，也需要注意，單純因?yàn)楣δ苋笔А⒖截悢?shù)變異等原因?qū)е碌淖蚤]癥，占自閉癥群體的總量并不多。

同時(shí)該方法目前也僅僅完成動(dòng)物試驗(yàn)，且試驗(yàn)的多是神經(jīng)特異性啟動(dòng)子（雖然對(duì)自閉癥來說是好事），具體的方法，在靈長(zhǎng)類生物或者人體內(nèi)的協(xié)同轉(zhuǎn)導(dǎo)效率如何，能否穩(wěn)定高效安全的實(shí)施，也有待檢驗(yàn)。

遞送內(nèi)容

類比

工作原理

目標(biāo)

基因片段

（cDNA）

“加裝備件”

將一個(gè)正常的基因副本送入細(xì)胞，讓細(xì)胞根據(jù)這個(gè)副本生產(chǎn)缺失的蛋白質(zhì)。

補(bǔ)償缺失或功能異常的基因。

基因編輯工具（CRISPR）

“現(xiàn)場(chǎng)手術(shù)”

遞送一套“手術(shù)器材”（如Casd9剪刀和sgRNA導(dǎo)航）直接對(duì)細(xì)胞內(nèi)原有的錯(cuò)誤DNA進(jìn)行剪切、刪除或修正。

永久性地更改細(xì)胞自身的基因組。

基因治療的兩種方法

但該方法的出現(xiàn)，將載體技術(shù)與編輯工具這兩個(gè)過去經(jīng)常被視為兩個(gè)獨(dú)立的研發(fā)方向，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)結(jié)合，即以后的基因治療，不管是遞送基因片段，還是遞送編輯工具，在載體方面，會(huì)有一個(gè)穩(wěn)定高效的選擇。

*本文經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院松江研究院資深研究員仇子龍審核發(fā)布。

參考資料：

1. https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.12.039

2. https://www.eurekalert.org/news-releases/1114326

3. http://aavlink.com/

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