撰文丨王聰

編輯丨王多魚

排版丨水成文

跨生物膜的分子轉(zhuǎn)運(yùn)對于生命活動(dòng)至關(guān)重要，它使細(xì)胞能夠獲取營養(yǎng)、排出廢物、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并與環(huán)境進(jìn)行信息交互。盡管跨膜功能蛋白的從頭設(shè)計(jì)已取得一定進(jìn)展，但如何構(gòu)建能夠穩(wěn)健、選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)特定小分子的人工跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體系，仍是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

近日，西湖大學(xué)盧培龍、馬丹、陳子博等在“浪淘沙預(yù)印本平臺”發(fā)布了題為：De novo design of dual-topology membrane transporters 的研究論文。

該研究從頭設(shè)計(jì)了雙拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（dual-topology membrane transporter），這些設(shè)計(jì)蛋白能在活細(xì)胞和人工囊泡中介導(dǎo)小分子染料的選擇性攝取，其功能類似于天然單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析顯示，其實(shí)際構(gòu)象與設(shè)計(jì)模型高度吻合，功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了雙拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制。

這項(xiàng)研究證實(shí)了以原子級精度從頭設(shè)計(jì)功能性動(dòng)態(tài)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是可行的，為了解轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的進(jìn)化起源提供了新視角，并為靶向藥物遞送、代謝通路工程等應(yīng)用開辟了新途徑。

膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：生命的“守門人”

生物膜是細(xì)胞的屏障，控制著物質(zhì)進(jìn)出。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白就像是細(xì)胞膜上的“智能門衛(wèi)”，負(fù)責(zé)選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)離子、營養(yǎng)物質(zhì)、藥物分子等，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。如果設(shè)計(jì)出人工轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，就能精準(zhǔn)控制細(xì)胞對特定物質(zhì)的吸收和排出，這在藥物遞送、代謝工程等領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。

然而，設(shè)計(jì)功能性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白極具挑戰(zhàn)性。它需要精確的三維結(jié)構(gòu)、特定的膜拓?fù)淙∠?、底物識別能力，以及關(guān)鍵的構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化——轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白需要在“內(nèi)向”“閉塞”和“外向”等狀態(tài)間切換，像“呼吸”一樣實(shí)現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。

巧借對稱性：雙拓?fù)湓O(shè)計(jì)簡化動(dòng)態(tài)機(jī)制

研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地采用了“雙拓?fù)洹痹O(shè)計(jì)策略。天然轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，EmrE 等少數(shù)蛋白采用這種架構(gòu)：單體以相反方向插入膜中，形成反平行二聚體。由于結(jié)構(gòu)對稱，內(nèi)向和外向構(gòu)象的能量接近，只需設(shè)計(jì)一個(gè)對稱的、底物結(jié)合的“閉塞狀態(tài)”，就能利用熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)構(gòu)象切換，實(shí)現(xiàn)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

研究通過參數(shù)化方程生成具有 C2 對稱性的六螺旋束骨架，中央預(yù)留底物結(jié)合口袋。研究團(tuán)隊(duì)選擇近對稱的染料分子 Cy3 作為模型底物，利用 Rosetta 和 ProteinMPNN 等設(shè)計(jì)工具優(yōu)化蛋白-配體界面和序列。

設(shè)計(jì)中，在膜-水界面引入兩環(huán)兩親性芳香族殘基，平衡正電荷分布，確保蛋白能雙向插入生物膜中。計(jì)算篩選出 216 個(gè)設(shè)計(jì)蛋白，最終 50 個(gè)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

高效轉(zhuǎn)運(yùn)：細(xì)胞和人工囊泡中驗(yàn)證功能

在基于大腸桿菌的底物攝取實(shí)驗(yàn)中，25 個(gè)設(shè)計(jì)蛋白顯示出強(qiáng)烈的 Cy3 染料積累，活性比對照組高出 13 倍以上。這些設(shè)計(jì)對 Cy3 表現(xiàn)出高度特異性，而對結(jié)構(gòu)相似的 Cy3 DA 或其他染料如 Lucifer yellow 和 Calcein 則幾乎無轉(zhuǎn)運(yùn)。

轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)呈時(shí)間和濃度依賴性，動(dòng)力學(xué)參數(shù)與天然轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相當(dāng)。競爭實(shí)驗(yàn)表明，Cy3 和 Lucifer yellow 共存時(shí)，設(shè)計(jì)蛋白選擇性轉(zhuǎn)運(yùn) Cy3，證實(shí)了路徑特異性。

點(diǎn)突變和化學(xué)修飾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了設(shè)計(jì)結(jié)合口袋的功能性。例如，將非極性氨基酸殘基突變?yōu)閹ж?fù)電的氨基酸殘基會抑制轉(zhuǎn)運(yùn)；在 Trans42_I7C 突變體中，MTSES 處理顯著抑制 Cy3 攝取，說明關(guān)鍵氨基酸殘基直接參與轉(zhuǎn)運(yùn)。

結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)：冷凍電鏡揭示原子級設(shè)計(jì)準(zhǔn)確性

盡管轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白尺寸小，研究團(tuán)隊(duì)通過融合剛性輔助域（例如 BRIL 或 MBP-DARPin）成功解析了 Trans25-sol 和 Trans42-TM 的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，分辨率分別達(dá) 2.93 ? 和 3.40 ?。

結(jié)構(gòu)顯示，跨膜域與設(shè)計(jì)模型高度一致，Cα RMSD 僅 1.2 ? 和 0.5 ?。中央空腔為底物結(jié)合位點(diǎn)，通道狹窄（半徑約 1.3 ?），需構(gòu)象變化才能允許底物通過。分子對接表明 Cy3 能完美契合設(shè)計(jì)位置。

體外和拓?fù)潋?yàn)證：功能廣泛適用

在無細(xì)胞的巨型單層囊泡（GUV）中，表達(dá)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的囊泡顯示 Cy3 熒光隨時(shí)間衰減，表明設(shè)計(jì)蛋白介導(dǎo)了底物外排。無功能的突變體則無此效應(yīng)，MTSES 敏感性也與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。

split-GFP 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了雙拓?fù)洳迦耄寒?dāng)?shù)鞍?N 端和 C 端同時(shí)融合 GFP 片段時(shí)，熒光強(qiáng)烈，說明兩端位于膜同側(cè)。單鏈版本仍保持轉(zhuǎn)運(yùn)活性，支持了設(shè)計(jì)模型的合理性。

從設(shè)計(jì)到進(jìn)化：啟示轉(zhuǎn)運(yùn)的起源

許多天然轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（例如 MFS 超家族）顯示內(nèi)部三重跨膜（3-TM）倒置重復(fù)，提示它們可能由原始 3-TM 雙拓?fù)淠K通過基因復(fù)制融合演化而來。該研究設(shè)計(jì)的 3-TM 雙拓?fù)涞鞍渍脼檫@一假說提供了證據(jù)，展示了最小對稱單元如何實(shí)現(xiàn)定向轉(zhuǎn)運(yùn)。

應(yīng)用前景：定制化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí)代

這項(xiàng)研究不僅證明了從頭設(shè)計(jì)動(dòng)態(tài)膜蛋白的可行性，還開辟了廣泛應(yīng)用：

• 靶向藥物遞送：設(shè)計(jì)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)抗癌藥物的蛋白，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。

• 細(xì)胞工廠：在工程化代謝途徑中控制化學(xué)物質(zhì)進(jìn)出，提高產(chǎn)量。

• 基礎(chǔ)研究：作為模型系統(tǒng)研究膜蛋白折疊、動(dòng)態(tài)和進(jìn)化。

總的來說，該研究通過深度學(xué)習(xí)和計(jì)算設(shè)計(jì)，首次實(shí)現(xiàn)了功能完備的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的從頭設(shè)計(jì)。這些蛋白結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)、動(dòng)態(tài)智能、功能可靠，標(biāo)志著蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)領(lǐng)域邁入新紀(jì)元。

“浪淘沙預(yù)印本平臺”（LangTaoSha Preprint Server）于 2025 年 11 月正式上線，是由深圳醫(yī)學(xué)科學(xué)院（SMART）與深圳灣實(shí)驗(yàn)室、清華大學(xué)、西湖大學(xué)以及其他頂尖高校和研究機(jī)構(gòu)合作建立的一個(gè)由科學(xué)家主導(dǎo)的開放科學(xué)平臺。

該平臺旨在為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究人員提供了一個(gè)高效、可靠且開放的學(xué)術(shù)交流環(huán)境。平臺支持研究成果在正式同行評議前的快速傳播，鼓勵(lì)實(shí)時(shí)討論，促進(jìn)更廣泛的科學(xué)合作。此外，該平臺還引入了區(qū)塊鏈技術(shù)，為每一篇上線的論文生成獨(dú)一無二且不可更改的時(shí)間戳與加密憑證，以確保科學(xué)記錄的完整性和可追溯性。最終目標(biāo)是構(gòu)建一個(gè)更透明、高效且有影響力的全球科學(xué)生態(tài)系統(tǒng)。

論文鏈接：

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