采用新生大鼠側(cè)腦室注射Shank3干擾慢病毒的方法構(gòu)建孤獨(dú)癥譜系障礙（ASD）相關(guān) Shank3 基因功能缺失模型。Shank3 是與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn) ASD 候選基因，其表達(dá)下調(diào)可模擬孤獨(dú)癥核心行為特征，如社交缺陷、重復(fù)刻板行為及認(rèn)知異常，為機(jī)制研究和干預(yù)探索提供可靠動(dòng)物模型。

Shank3干擾慢病毒側(cè)腦室注射造模

選用8只SPF級(jí)SD孕鼠，自然分娩后共獲得新生仔鼠70只。于出生后第3天（P3），對(duì)仔鼠進(jìn)行右側(cè)側(cè)腦室慢病毒立體定位注射，以構(gòu)建Shank3基因干擾模型。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，仔鼠隨機(jī)分為兩組：Shank3干擾組：注射1 μL含GFP熒光標(biāo)記的Shank3特異性shRNA慢病毒；空載對(duì)照組：注射1 μL含GFP的空載體慢病毒。

病毒溶液通過(guò)玻璃毛細(xì)針經(jīng)微量注射泵緩慢注入右側(cè)側(cè)腦室。注射完成后，將仔鼠置于熒光體視顯微鏡下，初步觀察側(cè)腦室區(qū)域GFP信號(hào)，確認(rèn)注射位置準(zhǔn)確。為驗(yàn)證病毒轉(zhuǎn)染效率，于注射后第3天（P6），每組隨機(jī)選取1只仔鼠，斷頭取腦，制備20 μm厚冰凍冠狀切片。在熒光顯微鏡下（10×物鏡）觀察發(fā)現(xiàn)，Shank3干擾組側(cè)腦室周圍細(xì)胞均呈現(xiàn)清晰、廣泛的GFP熒光表達(dá)，表明慢病毒成功感染并有效表達(dá)。

仔鼠飼養(yǎng)至P21時(shí)進(jìn)行單籠分養(yǎng)。從全部雄性仔鼠中隨機(jī)選取40只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；若出現(xiàn)不明原因脫毛（可能與應(yīng)激或個(gè)體健康狀況相關(guān)）則剔除，只選取健康雄性幼鼠（Shank3干擾組與空載對(duì)照組各18只）進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

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行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

為系統(tǒng)評(píng)估Shank3干擾對(duì)神經(jīng)發(fā)育及行為功能的影響，本研究在仔鼠P35–P40日齡期間依次開展以下四項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化行為學(xué)測(cè)試：

三箱社交實(shí)驗(yàn)（Three-Chamber Social Test）：

用于檢測(cè)社交趨近能力與社交新穎性偏好。實(shí)驗(yàn)裝置由三個(gè)等大相連的透明亞克力箱室組成（每室約20 cm × 40 cm × 22 cm），兩側(cè)箱室各放置一個(gè)帶孔圓柱籠（用于容納刺激動(dòng)物或物體）。

社交能力階段（P35）：將受試大鼠置于中室，適應(yīng)5 min后開始正式測(cè)試。一側(cè)籠內(nèi)放入陌生同性別SD大鼠（Stranger 1），另一側(cè)放入等體積無(wú)生命物體（Object 1）。記錄10 min內(nèi)受試鼠在左右箱室的停留時(shí)間及主動(dòng)嗅探時(shí)間。

社交新穎性階段：緊接著第一階段，將原Object 1替換為另一只新的陌生大鼠（Stranger 2），其余條件不變。再次記錄10 min內(nèi)受試鼠對(duì)熟悉鼠（Stranger 1）與新鼠（Stranger 2）的嗅探時(shí)間，評(píng)估其對(duì)社交新奇刺激的偏好。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open Field Test）：

用于評(píng)估焦慮樣行為及一般活動(dòng)水平。實(shí)驗(yàn)在100 cm × 100 cm × 40 cm的黑色不透明方形敞箱中進(jìn)行（P37）。將受試大鼠輕柔置于箱體中央，自動(dòng)視頻追蹤系統(tǒng)記錄其10 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡。主要分析指標(biāo)包括：

在中央?yún)^(qū)域（定義為距邊緣≥20 cm的正方形區(qū)域）與外周區(qū)域的停留時(shí)間；

總移動(dòng)距離（反映自發(fā)活動(dòng)能力）。

理毛行為實(shí)驗(yàn)（Self-Grooming Test）：

用于量化重復(fù)刻板行為。實(shí)驗(yàn)于P37在與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)相同的100 cm × 100 cm × 40 cm黑色敞箱中進(jìn)行。將受試大鼠單獨(dú)放入箱內(nèi)，允許其自由探索10 min，全程錄像。記錄大鼠自我理毛（包括舔前肢、擦拭面部、梳理軀干等連續(xù)動(dòng)作）的總持續(xù)時(shí)間。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris Water Maze, MWM）：

用于評(píng)估空間學(xué)習(xí)與長(zhǎng)期記憶能力，實(shí)驗(yàn)于P38–P42進(jìn)行。

定位航行訓(xùn)練（P38–P42，共5天）：圓形水池直徑120 cm，水深30 cm，水溫維持在22 ± 1°C，平臺(tái)位于西南象限，水面下1 cm不可見。每天將大鼠從四個(gè)不同起始象限隨機(jī)入水一次，限時(shí)90 s。若未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其上臺(tái)并停留15 s。記錄每次找到平臺(tái)的潛伏期和游泳路徑總長(zhǎng)度。

空間探索測(cè)試（P43）：移除平臺(tái)，將大鼠從原東北象限入水，自由游泳60 s。記錄其穿越原平臺(tái)所在位置（目標(biāo)象限內(nèi)直徑15 cm圓形區(qū)域）的次數(shù)、在目標(biāo)象限停留時(shí)間占比及總游泳距離，以評(píng)估空間記憶保持能力。

所有行為實(shí)驗(yàn)均在固定時(shí)間段（上午9:00–12:00）進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)測(cè)試房間至少30 min。設(shè)備在每只動(dòng)物使用后徹底清潔，避免氣味干擾。數(shù)據(jù)分析采用專業(yè)行為學(xué)軟件。

參考文獻(xiàn)：

• MINAKOVA E, LANG J, MEDEL-MATUS J S, et al. Melanotan-II reverses autistic features in a maternal immune activation mouse model of autism [J]. PLoS One, 2019, 14(1): e0210389.

• 陳曉芳,王娟,歐萍,等.黑皮質(zhì)素受體激動(dòng)劑改善Shank3基因缺陷孤獨(dú)癥模型大鼠行為的機(jī)制研究[J/OL].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,1-10[2026-01-01].

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