關(guān)于乳酸菌和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的關(guān)聯(lián)研究，現(xiàn)有文獻(xiàn)主要聚焦于乳酸菌的抗氧化性能上，而關(guān)于GPx在乳酸菌中的異源表達(dá)則相對(duì)有限；在其基因改造領(lǐng)域，大腸桿菌（

Escherichia coli

）作為表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用最為廣泛，然而，利用乳酸菌作為宿主菌進(jìn)行表達(dá)的研究鮮見報(bào)道。乳酸乳球菌被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為一般公認(rèn)安全（GRAS）微生物，是乳酸菌中最具代表性的菌株之一。由于其生長速度快、操作簡便且遺傳背景清晰，乳酸乳球菌已成為基因工程常用宿主菌。

廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院的彭靜靜，廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院的岳世陽、王成華*等人選擇目前應(yīng)用最為廣泛的模式乳酸菌NZ9000，旨在探究天然乳酸乳球菌合成硒蛋白的能力與特性。

目前，僅大腸桿菌的硒蛋白生物合成與插入途徑（SBIP）機(jī)制得到了較為明確的解析，且其調(diào)控因子在大腸桿菌中的同源過表達(dá)已被用于外源硒蛋白的表達(dá)，然而，SBIP在其他宿主菌中的代謝途徑改造鮮見報(bào)道，乳酸菌中硒蛋白的生物合成及其調(diào)控因子的研究也不深入。通過NCBI基因組檢索及原核生物硒蛋白基因預(yù)測(cè)程序bSECIS的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌中缺乏硒蛋白編碼基因及硒蛋白生物合成的相關(guān)調(diào)控因子。因此，本研究利用實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pNZ8148

GPx

，通過在

GPx

的 3 個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)（ C36 、 C63 、 C81 ）和倒數(shù)第 2 個(gè)的賴氨酸位點(diǎn)（ L156 ）的密碼子位置引入編碼硒代半胱氨酸（ Sec ）的終止密碼子 UGA 和順式作用元件硒代半胱氨酸插入元件（ SECIS ），嘗試在 GPx 重組乳酸菌 NG1（

L

lactis

NZ9000/pNZ8148-GPx ）內(nèi)通過定點(diǎn)突變 和反向長距聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR ） 構(gòu)建 5 個(gè)硒蛋白突變體。最終，對(duì)比這些突變體與本底菌 NG1 ，探討在缺乏大腸桿菌 SBIP 途徑中

SelA

（ Sec 合成酶）、

SelB

（特異翻譯延伸因子）、

SelC

（特異性識(shí)別 UGA 的 tRNA [Ser]sec ）和

SelD

（硒代磷酸合成酶）基因元件的情況下，僅引入 UGA 和 SECIS 的乳酸乳球菌對(duì)原核型或真核型硒蛋白基因的表達(dá)情況，以期為后期構(gòu)建新型硒蛋白及其乳酸菌細(xì)胞工廠提供參考。

1

LlGPx及其乳酸菌突變體的構(gòu)建

E. coli

MC1061/pNZ8148-GPx和5 個(gè)大腸桿菌MC1061突變體所提質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到L. lactis NZ9000，將長出的單克隆乳酸菌菌株分別擴(kuò)培和提質(zhì)粒后的酶切驗(yàn)證如圖2所示。

如圖2a所示，乳酸菌NZ9000內(nèi)的pNZ8148

GPx

在3 620 bp 處出現(xiàn)單一條帶， 5 個(gè)突變體重組質(zhì)粒也均在3 000 ～ 4 000 bp 中間位置出現(xiàn)條帶，與理論值預(yù)期相符。而圖 2b 表明，乳酸菌 NZ9000 內(nèi)的 pNZ8148

GPx

在 3122 bp處和 498 bp 處分別顯示出條帶， 5 個(gè)突變體重組質(zhì)粒也分別在 3 000 bp 和 500 bp 的鄰近位置出現(xiàn)條帶，與理論值預(yù)期相符。說明以上重組質(zhì)粒均電轉(zhuǎn)成功。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 C36U 、 C63U 、 C81U 、 L156U 和 L156U-Ter在乳酸菌內(nèi)構(gòu)建的準(zhǔn)確性，將所提質(zhì)粒送去華大基因公司測(cè)序（圖 3 ），測(cè)序結(jié)果用 Vector NT1 比對(duì)后表明它們的同源相似度為 100% ，即乳酸菌 LlGPx 的 5 個(gè)突變體構(gòu)建成功。

2

LlGPx及其突變體基因重組乳酸菌的SDS-PAGE驗(yàn)證

2.1 LlGPx的富硒表達(dá)驗(yàn)證

借助于末端融合的組氨酸標(biāo)簽（6×His tag），采用鎳離子金屬螯合親和層析純化了富硒誘導(dǎo)培養(yǎng)的重組LlGPx，SDS-PAGE驗(yàn)證和分離純化結(jié)果如圖4所示。圖4a 表明，富硒誘導(dǎo)后的NG1提取的粗酶液和純酶液中均出現(xiàn)表觀分子質(zhì)量約為17.8 kDa的目的條帶，與LlGPx的理論分子質(zhì)量大小相符。圖4b的親和層析純化結(jié)果顯示，在洗脫液為20%的梯度（即咪唑濃度為116 mol/L）時(shí)，獲得一個(gè)峰形好的蛋白組分峰，即為LlGPx。綜上，8 μg/mL的Na2SeO3富硒誘導(dǎo)條件實(shí)現(xiàn)了LlGPx的過表達(dá)。這與許多研究者利用乳酸菌將培養(yǎng)系統(tǒng)中的無機(jī)硒進(jìn)行富集并轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的結(jié)論一致。

2.2 LlGPx突變體基因重組乳酸菌的表達(dá)驗(yàn)證

LlGPx突變體基因重組乳酸菌在無Nisin誘導(dǎo)、Nisin誘導(dǎo)后以及富硒誘導(dǎo)后的SDS-PAGE驗(yàn)證如圖5所示。5 個(gè)突變體重組乳酸菌在無誘導(dǎo)（5～9泳道）時(shí)，沒有在對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)截短體或完整硒蛋白條帶，表明在pNZ8148

-GPx

的不同位置引入順式作用元件（SECIS）和表達(dá)Sec的密碼子（UGA），野生型乳酸乳球菌NZ9000均不支持突變體中Sec的表達(dá)或表達(dá)量很低以至于檢測(cè)不出。此外，該結(jié)果不受Nisin誘導(dǎo)或者富硒誘導(dǎo)的影響。從以上結(jié)果可以推斷，以NZ9000為代表的天然乳酸乳球菌中缺乏與大腸桿菌SBIP的同功能元件（如SelA～SelD），故無法按這個(gè)途徑過表達(dá)含Sec硒蛋白。即使單一引入SECIS或?qū)⑵渌稽c(diǎn)突變?yōu)楸磉_(dá)Sec的UGA，也沒法改變它本身對(duì)Sec不表達(dá)或表達(dá)率超低的現(xiàn)狀。因此，乳酸菌本身能產(chǎn)硒蛋白的機(jī)制值得進(jìn)一步被探討。為了進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)后期對(duì)這5 種突變體誘導(dǎo)后經(jīng)鎳離子金屬螯合柱（Ni-NTA柱）層析洗脫純化，但沒有得到如NG1誘導(dǎo)后的峰型圖和較純的LlGPx（圖4）。

3

LlGPx及其突變體的酶活性差異比較

由圖6可知，相對(duì)于原始的NG1，分別與無誘導(dǎo)和Nisin誘導(dǎo)的GPx活性最接近的是L156U和L156U-Ter，與富硒誘導(dǎo)后活性最接近的是C36U和L156U-Ter。其次，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)統(tǒng)一的規(guī)律：對(duì)于所有樣品粗酶液的GPx活性，均是無誘導(dǎo)組最低，Nisin誘導(dǎo)組活性居中，而富硒誘導(dǎo)后最高（其中，富硒誘導(dǎo)下LlGPx活性為89.10 mU/mg，突變體的GPx活性為56.17～84.45 mU/mg，兩者差異小）。主要是因?yàn)椋阂环矫妫萌樗峋鶱ICE系統(tǒng)，添加Nisin誘導(dǎo)劑可提高蛋白的表達(dá)量；另一方面，乳酸菌接種到含亞硒酸鈉的液體培養(yǎng)基中并在37 ℃溫度下靜態(tài)培養(yǎng)能顯著提高乳酸菌GPx活性。然而，突變體乳酸菌無論是否誘導(dǎo)，活性都是非常低（28.03～84.45 mU/mg）。綜上，Nisin和富硒誘導(dǎo)均可使原始菌NG1和5 個(gè)突變菌的活性有顯著性的提高，但誘導(dǎo)與否的粗酶液LlGPx活性不存在數(shù)量級(jí)的差別。

根據(jù)活性位點(diǎn)氨基酸的不同，GPx一般分為兩類：1）活性中心為Sec的含硒GPx：包括GPx1、GPx2、GPx3、GPx4和GPx6；2）活性中心為Cys的非硒GPx：包括GPx5、GPx7和GPx8。因含硒GPx被證實(shí)具有更高的活性。因此，本研究嘗試將GPx上的Cys替換為Sec。然而即使引入編碼Sec的UGA和Sec插入元件SECIS，UGA在5 個(gè)乳酸乳球菌突變體中的通讀率仍非常低以至于沒有檢測(cè)出含Sec硒蛋白的表達(dá)（圖5），檢測(cè)到的GPx活性很可能歸因于NZ9000基因組GPx基因的本底表達(dá)，也可能存在包括微量Sec隨機(jī)摻入在內(nèi)的UGA通讀生成重組GPx的機(jī)制，這有待進(jìn)一步研究。

結(jié)論

本研究通過在乳酸乳球菌內(nèi)構(gòu)建LlGPx及在其不同位置引入順式作用元件SECIS和表達(dá)Sec的密碼子UGA，構(gòu)建了5 個(gè)LlGPx突變體（C36U、C63U、C81U、L156U、L156U-Ter），以研究天然乳酸乳球菌對(duì)原核型和真核型硒蛋白的合成情況。通過酶切和測(cè)序驗(yàn)證5 個(gè)LlGPx突變體構(gòu)建成功。在Nisin或富硒誘導(dǎo)條件下，對(duì)5 個(gè)乳酸菌突變體的粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證，結(jié)果表明均沒有在預(yù)期位置出現(xiàn)顯著的硒蛋白完整或截?cái)鄺l帶。同時(shí)在無誘導(dǎo)、Nisin誘導(dǎo)和富硒誘導(dǎo)3 種培養(yǎng)條件下檢測(cè)到的GPx活性均很低（28.03～84.45 mU/mg），不存在數(shù)量級(jí)的差別。綜上，由于NZ9000缺乏大腸桿菌SBIP途徑內(nèi)合成Sec的關(guān)鍵基因元件（即

SelA

SelD

），故無法通過該途徑過表達(dá)含Sec的硒蛋白；即使單一引入SECIS或?qū)⑵渌稽c(diǎn)突變?yōu)楸磉_(dá)Sec的UGA，也無法改變其對(duì)UGA通讀率極低的現(xiàn)狀。該研究為富硒乳酸菌產(chǎn)有機(jī)硒蛋白的深入研究及其未來在食品、醫(yī)藥等方面的推廣應(yīng)用提供了重要參考。

本文《天然乳酸乳球菌硒蛋白表達(dá)機(jī)制及酶活特性》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第19期116-123頁，作者：彭靜靜，岳世陽，盧良華，劉小玲，王成華。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20250203-004。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：魏雨諾；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)