細(xì)胞表面蛋白是臨床上重要的作用靶點(diǎn)，在細(xì)胞通訊、信號傳導(dǎo)和穩(wěn)態(tài)維持中起著關(guān)鍵作用。然而，目前針對這些靶點(diǎn)生成高親和力分子探針（如核酸適體）的方法仍然有限。傳統(tǒng)方法通量低，且常在篩選過程中破壞蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，導(dǎo)致大量靶點(diǎn)未被充分探索，從而阻礙了基于適體的診斷與治療開發(fā)。

鑒于此，中國科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所譚蔚泓院士、吳芩研究員等開發(fā)了一種名為SPARK-seq（單細(xì)胞擾動驅(qū)動的適體識別與動力學(xué)測序）的高通量平臺。該平臺將CRISPR基因擾動與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及適體測序相結(jié)合，可在天然細(xì)胞環(huán)境中高效、系統(tǒng)地繪制適體?靶標(biāo)相互作用圖譜。通過一次實(shí)驗(yàn)，SPARK-seq成功將5535種不同的適體映射到8個表面蛋白上，覆蓋了超過兩個數(shù)量級的蛋白豐度范圍，并能夠區(qū)分高度同源的旁系同源蛋白。該平臺還可提供動力學(xué)信息，優(yōu)先篩選出解離速率慢的適體，并借助深度學(xué)習(xí)框架SPARTA進(jìn)行適體預(yù)測與變體生成，為精準(zhǔn)診斷與治療提供了強(qiáng)大的分子工具開發(fā)平臺。相關(guān)研究成果以題為“SPARK-seq: A high-throughput platform for aptamer discovery and kinetic profiling”發(fā)表在最新一期《science》上，羅國焰、宋佳為論文共同第一作者。

【SPARK-seq工作流程】

SPARK-seq整合了多重CRISPR介導(dǎo)的基因敲除與單細(xì)胞RNA測序。首先，研究人員設(shè)計(jì)了一個與單細(xì)胞測序兼容的適體文庫，其核心為46個隨機(jī)核苷酸區(qū)域，兩端分別帶有32 nt的5’ PCR手柄和22 nt的3’捕獲序列（圖1A）。經(jīng)過四輪Cell-SELEX篩選，獲得了與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的富集適體文庫（圖1B）。隨后，該文庫與經(jīng)過CRISPR敲除不同表面蛋白的混合細(xì)胞群共同孵育，并進(jìn)行10X Genomics 5’端測序。在此檢測中，gRNA、適體和mRNA分別通過CRISPR捕獲引物、模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸（TSO）和poly(T)序列被捕獲（圖1C）。測序后，通過識別和校正每個組學(xué)層的細(xì)胞條形碼，將每個細(xì)胞及其對應(yīng)的擾動與適體結(jié)合譜關(guān)聯(lián)起來（圖1D，圖1E）。

圖 1. SPARK-seq 工作流程概述

【概念驗(yàn)證】

為驗(yàn)證SPARK-seq能否有效建立基因敲除、細(xì)胞表型與適體結(jié)合之間的直接關(guān)聯(lián)，研究團(tuán)隊(duì)以蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）為靶點(diǎn)進(jìn)行了概念驗(yàn)證。使用PTK7特異性適體sgc8c，在人和小鼠細(xì)胞系中進(jìn)行了CRISPR敲除。Western blot和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)PTK7敲除細(xì)胞中PTK7表達(dá)及sgc8c結(jié)合均顯著下降（圖2A，圖2B）。經(jīng)過序列修飾的sgc8c-S在SPARK-seq中同時分析了PTK7 gRNA、mRNA和適體結(jié)合信號（圖2C）。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組UMAP圖譜清晰區(qū)分了人和小鼠細(xì)胞（圖2D），而sgc8c-S結(jié)合譜顯示，不含PTK7 gRNA的細(xì)胞結(jié)合信號高，表達(dá)PTK7 gRNA的細(xì)胞結(jié)合信號顯著降低（圖2E-圖2G），證實(shí)了SPARK-seq在單細(xì)胞水平關(guān)聯(lián)遺傳擾動與適體結(jié)合的能力。

圖 2. SPARK-seq 與 SGC8c 適體的概念驗(yàn)證

【SPARK-seq繪制適體?靶標(biāo)相互作用圖譜】

為探索SPARK-seq能否對混合遺傳擾動細(xì)胞群實(shí)現(xiàn)高通量適體靶標(biāo)識別，研究人員對SUM159PT細(xì)胞進(jìn)行了四輪Cell-SELEX篩選，獲得了富集文庫R4（圖1B）。通過pull-down聯(lián)合質(zhì)譜分析篩選回合中的潛在靶標(biāo)，最終選擇了13個膜蛋白進(jìn)行CRISPR擾動（每個蛋白3個不同的gRNA）。將混合擾動細(xì)胞群與R4文庫孵育后進(jìn)行SPARK-seq分析。經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)控，最終保留了8466個高質(zhì)量單細(xì)胞，涉及34個不同的gRNA表達(dá)群體。對適體序列進(jìn)行分析，從4.027×10?個獨(dú)特序列中選取了占總讀數(shù)68.84%的前10,000個序列進(jìn)行下游分析。通過BLAST和馬爾可夫聚類（MCL）算法將這些序列歸類為1906個適體家族（圖3A，圖3B）。SPARTA算法通過結(jié)合結(jié)合差異計(jì)算、質(zhì)量控制與評分系統(tǒng)，最終成功識別出12個適體家族與9個不同擾動細(xì)胞群之間的特異性結(jié)合差異（圖3C-圖3F）。例如，家族5、13、17靶向CDCPI；家族3靶向ITGA3/ITGB1；家族2、6、7靶向NRP1等（圖3G）。

圖 3. 高通量適配體-靶點(diǎn)定位流程

【適體?靶標(biāo)相互作用的驗(yàn)證】

為驗(yàn)證SPARK-seq/SPARTA預(yù)測的相互作用，研究人員通過流式細(xì)胞術(shù)、表面等離子體共振（SPR）和微量熱泳動（MST）等多種正交方法進(jìn)行了確認(rèn)。以PTK7靶向適體為例，Apt-1-1和Apt-15-27均能特異性結(jié)合表達(dá)PTK7的細(xì)胞，而在PTK7敲除細(xì)胞中結(jié)合喪失（圖4B）。SPR和MST測定證實(shí)其對PTK7蛋白具有納摩爾級的親和力（圖4C）。類似地，針對CDCPI、NRP1、NRP2等靶點(diǎn)的適體也通過了驗(yàn)證（圖4D-圖4I，圖4Y）。研究還發(fā)現(xiàn)了多靶點(diǎn)結(jié)合的適體，如家族3的Apt-3-3同時需要ITGA3和ITGB1才能結(jié)合（圖4N，圖4O），家族4的Apt-4-5能同時結(jié)合PTPRD、PTPRF和PTPRS三個高度同源的蛋白（圖4Q，圖4T，圖4W，圖4R，圖4U，圖4X）。最終，SPARK-seq成功繪制了5535個適體序列與8個表面蛋白（PTK7、ITGA3、CDCPI、NRP1、NRP2、PTPRD、PTPRF、PTPRS）之間的相互作用圖譜（圖4Z）。

圖 4. 適配體靶點(diǎn)驗(yàn)證

【適體特異性的正交驗(yàn)證】

通過流式競爭實(shí)驗(yàn)、生物素化適體pull-down結(jié)合免疫印跡以及SPR交叉結(jié)合實(shí)驗(yàn)等多層次驗(yàn)證，證實(shí)了SPARK-seq衍生適體具有高度的分子特異性（圖5A，圖5B）。例如，盡管NRP1和NRP2結(jié)構(gòu)高度相似（圖5C），但SPARK-seq鑒定出了分別特異性結(jié)合NRP1或NRP2且無交叉反應(yīng)的適體（圖5D）。NRP1適體能競爭性阻斷VEGF165的結(jié)合，而NRP2適體則結(jié)合在一個不干擾VEGF165、VEGF-C或TGF-β1結(jié)合的非經(jīng)典位點(diǎn)上（圖5E，圖5F）。驗(yàn)證的8個靶標(biāo)在等電點(diǎn)、疏水性、結(jié)構(gòu)域組成和細(xì)胞表面表達(dá)豐度上呈現(xiàn)廣泛差異（圖5G），表明SPARK-seq能夠發(fā)現(xiàn)針對表達(dá)量跨越兩個數(shù)量級以上、具有不同理化特性的細(xì)胞表面蛋白的適體，其基于單細(xì)胞差異篩選的策略相比傳統(tǒng)方法更能發(fā)現(xiàn)如CDCPI等可能被常規(guī)生化技術(shù)遺漏的靶標(biāo)。

圖 5. 適配體特異性驗(yàn)證

【SPARK-seq優(yōu)先篩選慢解離速率適體】

研究發(fā)現(xiàn)，SPARK-seq的富集偏好與適體的解離速率（koff）強(qiáng)相關(guān)，而非平衡親和力（KD）。對于靶向PTK7的適體，其結(jié)合差異（?log?FC）與koff在流式細(xì)胞術(shù)、SPR和實(shí)時相互作用細(xì)胞術(shù)（RT?IC）中均顯示出強(qiáng)相關(guān)性（R2分別為0.84、0.88、0.87），而與KD相關(guān)性弱（圖6A-圖6F）。這一規(guī)律在其他靶點(diǎn)如CDCPI、NRP1、NRP2、PTPRF中也得到證實(shí)（圖6G-圖6J）。與傳統(tǒng)篩選方法傾向于選擇拷貝數(shù)最高的適體不同，SPARK-seq篩選出的具有最高?log?FC值的適體通常具有顯著更慢的解離速率（圖6K-圖6P），這對于需要長時間靶標(biāo)占據(jù)的治療和診斷應(yīng)用至關(guān)重要。

圖 6. 鑒定具有明顯解離動力學(xué)的適配體

【總結(jié)與展望】

SPARK-seq通過整合CRISPR基因擾動、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與適體測序，建立了一個能夠在天然細(xì)胞環(huán)境中高通量、高特異性鑒定適體?靶標(biāo)相互作用并解析其動力學(xué)的強(qiáng)大平臺。它不僅克服了傳統(tǒng)方法對高豐度蛋白的偏好和PCR偏倚，還能有效區(qū)分同源蛋白并優(yōu)先篩選具有慢解離特性的適體，為開發(fā)更優(yōu)的診斷和治療性適體提供了新范式。未來，通過使用化學(xué)修飾文庫、更高通量的平臺、優(yōu)化的CRISPR策略以及競爭性篩選，SPARK-seq有望進(jìn)一步擴(kuò)展其應(yīng)用范圍，例如通過基因組規(guī)模的CRISPR篩選系統(tǒng)繪制適體與未知表面蛋白的相互作用圖譜，或通過細(xì)胞透化技術(shù)探索細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)，從而推動“適體組學(xué)”發(fā)展和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。