文獻(xiàn)題目：Low reactogenicity and high tumour antigen expression from mRNA-LNPs with membrane-destabilizing zwitterionic lipids（具有膜破壞性兩性離子脂質(zhì)的mRNA-LNP具有低反應(yīng)原性和高腫瘤抗原表達(dá)）

發(fā)表期刊：

Nature Biomedical Engineering

研究團(tuán)隊(duì)：康奈爾大學(xué)江紹毅教授團(tuán)隊(duì)

主要研究結(jié)果：研發(fā)出一種膜破壞性兩性離子（MeDZ）可電離脂質(zhì)，將其整合到脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)中用于包封mRNA，在生理pH下保持良好生物相容性，在內(nèi)涵體酸性環(huán)境中快速質(zhì)子化，促進(jìn)mRNA高效表達(dá)；同時(shí)顯著降低注射部位炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，在小鼠黑色素瘤模型中實(shí)現(xiàn)腫瘤發(fā)生預(yù)防、肺轉(zhuǎn)移抑制、腫瘤生長(zhǎng)干預(yù)及復(fù)發(fā)減少，且與免疫檢查點(diǎn)阻斷療法協(xié)同增效，為mRNA癌癥疫苗的臨床轉(zhuǎn)化提供了新方案。

研究背景

當(dāng)前mRNA癌癥疫苗走向臨床應(yīng)用的兩大核心障礙尤為突出。其一，是mRNA表達(dá)效率有限。mRNA疫苗進(jìn)入細(xì)胞后，大多被內(nèi)涵體捕獲，難以逃逸到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，而癌癥疫苗對(duì)腫瘤抗原的表達(dá)量要求更高，需要更高效的內(nèi)涵體逃逸機(jī)制才能滿足治療需求。其二，是不可避免的炎癥反應(yīng)（反應(yīng)原性）。脂質(zhì)納米顆粒（LNP）作為mRNA遞送的關(guān)鍵載體，其成分尤其是可電離脂質(zhì)，容易引發(fā)注射部位紅腫、疼痛等局部炎癥。

以上現(xiàn)狀促使研究團(tuán)隊(duì)致力于開(kāi)發(fā)新型遞送系統(tǒng)。

核心內(nèi)容詳解

（一）MeDZ脂質(zhì)的設(shè)計(jì)與LNP合成

研究方法

研究團(tuán)隊(duì)基于兩性離子材料的優(yōu)良生物相容性和可電離脂質(zhì)的pH響應(yīng)特性，設(shè)計(jì)了MeDZ脂質(zhì)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)：采用吡啶基羧酸甜菜堿（PyCB）作為親水頭基，搭配可降解的疏水性多尾烷基鏈和叔胺連接體。合成過(guò)程通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)將各功能結(jié)構(gòu)域連接，經(jīng)核磁共振（NMR）光譜驗(yàn)證結(jié)構(gòu)正確性，并通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射、透射電鏡等技術(shù)表征其物理化學(xué)性質(zhì)。

為構(gòu)建MeDZ LNP，研究團(tuán)隊(duì)改良了商業(yè)化BNT162b2 LNP的配方，用MeDZ脂質(zhì)逐步替換原有ALC-0315可電離脂質(zhì)，調(diào)整摩爾比例從0%到50%，制備系列MeDZ LNP制劑，并對(duì)其粒徑、zeta電位、等電點(diǎn)（pI）、mRNA包封效率及細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MeDZ脂質(zhì)的PyCB頭基在生理pH（7.4）下可與水形成氫鍵復(fù)合物，呈現(xiàn)兩性離子特性；當(dāng)pH低于6.8（接近內(nèi)涵體pH 5.9~6.2）時(shí)，快速轉(zhuǎn)化為帶正電的質(zhì)子化狀態(tài)（PyCB–H?O?），且計(jì)算模擬證實(shí)該質(zhì)子化狀態(tài)熱力學(xué)更穩(wěn)定。

系列MeDZ LNP制劑的粒徑均在100~120 nm，與BNT162b2 LNP相近，mRNA包封效率均超過(guò)80%，細(xì)胞毒性可忽略不計(jì)。其中，MeDZ（25%）LNP的等電點(diǎn)為6.61，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出最佳的mRNA遞送效能。

（二）體外效能評(píng)估

研究方法

mRNA 表達(dá)效率檢測(cè)：將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）mRNA封裝于不同比例MeDZ LNP中，與DC2.4細(xì)胞共孵育，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFP熒光強(qiáng)度，評(píng)估m(xù)RNA表達(dá)水平。

細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)：采用Cy5標(biāo)記的mRNA制備LNP，孵育DC2.4細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cy5熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞攝取能力。

內(nèi)涵體逃逸驗(yàn)證：通過(guò)F?rster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）實(shí)驗(yàn)評(píng)估LNP對(duì)內(nèi)涵體模擬脂質(zhì)體的破壞能力；利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察NBD標(biāo)記LNP與LysoTracker紅染色內(nèi)涵體的共定位情況，計(jì)算Pearson共定位系數(shù)；通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LNP在酸性條件下的膜破壞活性。

抗原呈遞檢測(cè)：將卵清蛋白（OVA）mRNA封裝于MeDZ LNP，轉(zhuǎn)染BMDCs后，通過(guò)Western blot檢測(cè)OVA蛋白表達(dá)量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面MHC-I分子呈遞的OVA抗原片段（H2Kb-SIINFEKL）水平。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MeDZ（25%）LNP在DC2.4細(xì)胞中的EGFP表達(dá)效率達(dá)到BNT162b2 LNP的 1.7 倍，且細(xì)胞攝取能力與BNT162b2 LNP相近，證實(shí)其高效表達(dá)源于內(nèi)涵體逃逸效率的提升。

FRET實(shí)驗(yàn)顯示，在pH 6.0條件下，MeDZ LNP對(duì)內(nèi)涵體模擬脂質(zhì)體的破壞率顯著高于BNT162b2 LNP。

CLSM結(jié)果顯示，MeDZ LNP組的NBD熒光與LysoTracker紅熒光共定位系數(shù)（0.78）低于BNT162b2 LNP組（0.90），表明更多mRNA逃逸到細(xì)胞質(zhì)中。溶血實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MeDZ LNP在內(nèi)涵體pH下具有更強(qiáng)的膜破壞活性。

在抗原呈遞實(shí)驗(yàn)中，MeDZ LNP轉(zhuǎn)染的BMDCs中OVA蛋白表達(dá)量顯著高于BNT162b2 LNP組，細(xì)胞表面H2Kb-SIINFEKL高表達(dá)細(xì)胞比例達(dá)到16.0%，遠(yuǎn)高于BNT162b2 LNP組的9.26%，為后續(xù)激發(fā)特異性T細(xì)胞應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。

（三）體內(nèi)遞送與安全性評(píng)估

研究方法

體內(nèi)mRNA表達(dá)檢測(cè)：將螢火蟲(chóng)熒光素酶（Luc）mRNA與 DiR標(biāo)記的MeDZ LNP經(jīng)皮下注射到C57BL/6小鼠尾基部，6小時(shí)后通過(guò)IVIS成像系統(tǒng)觀察淋巴結(jié)中熒光素酶表達(dá)和LNP分布。

細(xì)胞靶向性驗(yàn)證：向Ai14小鼠皮下注射Cre mRNA負(fù)載的MeDZ LNP，48小時(shí)后收集腹股溝淋巴結(jié)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同免疫細(xì)胞中tdTomato陽(yáng)性細(xì)胞比例，明確LNP的靶向細(xì)胞類型。

反應(yīng)原性評(píng)估：C57BL/6小鼠皮下注射MeDZ LNP后3天，收集注射部位皮膚組織，通過(guò)Luminex技術(shù)檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子（GM-CSF、IL-1β、IL-6）水平，流式細(xì)胞術(shù)分析CD45+細(xì)胞中中性粒細(xì)胞比例，HE染色觀察組織炎癥病理變化；檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平評(píng)估肝毒性。

低炎癥機(jī)制探究：通過(guò)Western blot檢測(cè)DC2.4細(xì)胞中NF-κB通路激活情況，結(jié)合RNA測(cè)序分析差異表達(dá)基因，探究MeDZ LNP低炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

體內(nèi)成像結(jié)果顯示，MeDZ（25%）LNP在淋巴結(jié)中聚集并表現(xiàn)出最高的熒光素酶表達(dá)效率，內(nèi)涵體逃逸效率達(dá)到BNT162b2 LNP的1.7倍。

Ai14小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MeDZ LNP可高效靶向淋巴結(jié)中的抗原呈遞細(xì)胞，5.06%的樹(shù)突狀細(xì)胞和4.57%的巨噬細(xì)胞成功表達(dá)tdTomato。

安全性評(píng)估顯示，MeDZ LNP組注射部位皮膚組織的GM-CSF、IL-1β、IL-6水平僅為BNT162b2 LNP組的 41.8%~65.7%，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)比例顯著降低，皮膚紅腫等炎癥表現(xiàn)明顯減輕；血清ALT和AST水平無(wú)顯著升高。

機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，MeDZ LNP對(duì)DC2.4細(xì)胞中NF-κB通路的激活作用顯著弱于BNT162b2 LNP，RNA測(cè)序顯示其主要激活抗原加工呈遞通路，而炎癥相關(guān)通路激活程度溫和。

小結(jié)

MeDZ LNP 經(jīng)皮下注射后可高效靶向淋巴結(jié)中的抗原呈遞細(xì)胞，在實(shí)現(xiàn) mRNA 高效表達(dá)的同時(shí)，顯著降低載體的反應(yīng)原性。

（四）腫瘤防治效能評(píng)估

研究方法

預(yù)防性實(shí)驗(yàn)：C57BL/6小鼠分別接種PBS、BNT162b2 LNP-OVA mRNA、MeDZ LNP-OVA mRNA，第0天初免，第5、10天加強(qiáng)免疫，第14天檢測(cè)血清OVA特異性IgM 和IgG水平；第15天接種B16F10-OVA腫瘤細(xì)胞，監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴結(jié)中抗原呈遞水平、血液中OVA特異性CD8+ T細(xì)胞比例及脾臟中記憶 T 細(xì)胞亞群（TEM、TCM）比例。

肺轉(zhuǎn)移抑制實(shí)驗(yàn)：小鼠靜脈接種B16F10-OVA腫瘤細(xì)胞后，第1、6、11天接種不同疫苗制劑，第20天處死小鼠，觀察肺組織腫瘤結(jié)節(jié)形成情況并進(jìn)行HE染色分析。

復(fù)發(fā)干預(yù)實(shí)驗(yàn)：小鼠靜脈接種B16F10-OVA腫瘤細(xì)胞并接種MeDZ LNP疫苗后，第30天在左右側(cè)分別皮下接種B16F10-OVA和EO771腫瘤細(xì)胞，監(jiān)測(cè)兩種腫瘤的生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)和OVA特異性T細(xì)胞比例。

治療性實(shí)驗(yàn)：小鼠皮下接種B16F10-OVA腫瘤細(xì)胞6天后，分別接種不同疫苗制劑，監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)和小鼠存活情況；另設(shè)聯(lián)合治療組，在疫苗接種當(dāng)天及后續(xù)加強(qiáng)免疫后1天腹腔注射抗PD-1抗體，評(píng)估協(xié)同治療效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

預(yù)防性實(shí)驗(yàn)中，MeDZ LNP疫苗組小鼠血清OVA特異性IgG水平顯著高于BNT162b2 LNP組，接種腫瘤細(xì)胞后全部小鼠無(wú)腫瘤生長(zhǎng)，而B(niǎo)NT162b2 LNP組4/6只小鼠實(shí)現(xiàn)完全應(yīng)答。

流式細(xì)胞術(shù)顯示，MeDZ LNP組淋巴結(jié)中樹(shù)突狀細(xì)胞表面H2Kb-SIINFEKL高表達(dá)比例達(dá)4.97%，血液中OVA特異性CD8+ T細(xì)胞比例為2.80%，脾臟中TEM和TCM細(xì)胞比例顯著升高。

肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，PBS組小鼠肺組織出現(xiàn)大量腫瘤結(jié)節(jié)，BNT162b2 LNP組結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少，而MeDZ LNP組肺組織未觀察到腫瘤結(jié)節(jié)。

復(fù)發(fā)干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，MeDZ LNP疫苗可完全抑制B16F10-OVA腫瘤復(fù)發(fā)（5只小鼠中3只無(wú)腫瘤生長(zhǎng)），但對(duì)非同源EO771腫瘤生長(zhǎng)抑制作用微弱，證實(shí)其激發(fā)的免疫應(yīng)答具有抗原特異性；腫瘤組織中CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)比例達(dá)40.2%，OVA特異性T細(xì)胞比例為5.52%，顯著高于PBS組。

治療性實(shí)驗(yàn)中，MeDZ LNP疫苗組小鼠腫瘤生長(zhǎng)顯著抑制，40天存活率達(dá)40%，而PBS組和BNT162b2 LNP組存活率均為0；與抗PD-1抗體聯(lián)合治療后，6只小鼠中3只實(shí)現(xiàn)腫瘤完全抑制，60天存活率提升至50%，顯著優(yōu)于單獨(dú)治療組。

實(shí)驗(yàn)小結(jié)

MeDZ LNP疫苗通過(guò)高效激發(fā)抗原特異性細(xì)胞免疫和免疫記憶，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的全方位防控；在已建立的腫瘤模型中展現(xiàn)出顯著的治療效果，且與免疫檢查點(diǎn)阻斷療法協(xié)同增效。

（五）SORT LNP拓展應(yīng)用

研究方法

研究團(tuán)隊(duì)將其整合到已報(bào)道的脾臟靶向 SORT LNP 中，制備SORT MeDZ LNP，以Luc mRNA為報(bào)告基因，靜脈注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)，通過(guò)IVIS成像系統(tǒng)觀察脾臟中mRNA表達(dá)情況；以O(shè)VA mRNA為模型抗原，評(píng)估SORT MeDZ LNP激發(fā)OVA特異性CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答的能力；通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其內(nèi)涵體膜破壞能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SORT MeDZ LNP在脾臟中的蓄積未受顯著影響，但mRNA表達(dá)效率顯著提升；流式細(xì)胞術(shù)顯示，SORT MeDZ LNP組小鼠OVA特異性CD8+ T細(xì)胞比例達(dá)7.43%，高于SORT LNP組（5.32%）和非pH響應(yīng)性CB脂質(zhì)構(gòu)建的SORT CB LNP組（3.42%）；溶血實(shí)驗(yàn)證實(shí)SORT MeDZ LNP在內(nèi)涵體pH下具有更強(qiáng)的膜破壞活性。

小結(jié)

MeDZ脂質(zhì)可與現(xiàn)有靶向遞送系統(tǒng)兼容，通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)涵體逃逸效率提升 mRNA 表達(dá)和免疫激活效果。

小結(jié)

本研究針對(duì) mRNA 癌癥疫苗遞送效率低、反應(yīng)原性高的核心瓶頸，創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)了膜破壞性兩性離子可電離脂質(zhì)（MeDZ），構(gòu)建了高效低毒的 mRNA-LNP 遞送系統(tǒng)。通過(guò) PyCB 頭基的 pH 響應(yīng)性質(zhì)子化機(jī)制，實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體高效逃逸與 mRNA 高效表達(dá)；借助兩性離子結(jié)構(gòu)特性，顯著降低載體反應(yīng)原性，實(shí)現(xiàn)療效與安全性的完美平衡。在小鼠黑色素瘤模型中，該系統(tǒng)展現(xiàn)出全面的腫瘤防治效能，且與免疫檢查點(diǎn)阻斷療法協(xié)同增效，同時(shí)兼容現(xiàn)有靶向遞送系統(tǒng)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] Zhao Y, Li R, Liu P, Wang J, Cui Y, Ma Y, Cao Z, Cui M, Luozhong S, Wagner E, Laflin A, Ding Y, Hu Y, Tian Z, Tang C, Cai S, Young H, Liu D, Gu W, Bailey S, Jiang S. Low reactogenicity and high tumour antigen expression from mRNA-LNPs with membrane-destabilizing zwitterionic lipids. Nat Biomed Eng. 2025 Dec 18.

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撰寫(xiě)| RNA星球

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設(shè)計(jì)| Alice