清醒小鼠頭部固定是一種常用技術(shù)用于在動物保持清醒狀態(tài)下進(jìn)行高精度的神經(jīng)記錄（如雙光子成像、虛擬現(xiàn)實、寬場成像、在體電生理記錄等），同時避免運動偽影。

多電極陣列（如Neuropixels探針）能夠以高時間分辨率對大量單個神經(jīng)元進(jìn)行電生理記錄。通過使用這類探針可在同一動物體內(nèi)同時測量功能上相互關(guān)聯(lián)但解剖位置不同的多個腦區(qū)的神經(jīng)活動。然而，在小鼠等小型動物中使用多個探針需要移除相當(dāng)大一部分顱骨，同時必須盡量減少組織損傷并在記錄過程中保持大腦穩(wěn)定。

Fig1 頭架與顱骨開窗植入術(shù)

顱骨開窗：

選項 A（急性記錄）：暫不開窗，僅預(yù)留區(qū)域，記錄當(dāng)天再開。

選項 B（慢性窗口）：

在頭架中央開口內(nèi)，用精細(xì)顱骨鉆（<0.5 mm）緩慢磨出一個大范圍薄層顱骨窗（如 4×4 mm2），或多個小孔（用于多探針）。接近硬腦膜時改用鑷子或針尖輕柔剝離殘余骨片，避免損傷硬腦膜或引起出血。若需長期成像，可保留完整硬腦膜；若用于電極插入，可小心移除。

Neuropixels 多探針清醒小鼠記錄

階段一：頭架與可拆卸玻璃蓋片植入

術(shù)前準(zhǔn)備：

小鼠（通常為成年 C57BL/6 或轉(zhuǎn)基因品系）經(jīng)適應(yīng)性訓(xùn)練，熟悉抓握和輕度約束。術(shù)前給予鎮(zhèn)痛藥（如布洛芬或卡洛芬）和抗生素。使用異氟烷維持麻醉，配合眼膏防干。

立體定位手術(shù)：

固定小鼠于立體定位儀，剃毛、消毒頭皮。沿中線切開皮膚，剝離筋膜，暴露顱骨。清理顱骨表面（H?O? 或生理鹽水），確保干燥無出血。

頭架固定：

使用牙科水泥將定制金屬或3D打印頭架牢固粘附于顱骨（覆蓋頂骨及部分額骨）。

頭架中央預(yù)留一個大開口（直徑約 8–10 mm），用于后續(xù)多探針插入。

植入可拆卸玻璃蓋片：

在頭架開口處覆蓋一塊圓形玻璃蓋片，用少量快速固化膠（如 UV 膠）臨時固定。蓋片可在記錄前移除，避免阻礙探針插入。

術(shù)后恢復(fù)：

縫合皮膚邊緣，給予術(shù)后鎮(zhèn)痛 48–72 小時?；謴?fù)期 ≥7 天，并進(jìn)行清醒頭部固定適應(yīng)訓(xùn)練（每天 10–30 分鐘，持續(xù) 3–5 天）。

階段二：探針精確定位與成像窗口安裝（記錄當(dāng)天）

移除玻璃蓋片：

輕柔取下臨時玻璃蓋片，暴露完整顱骨窗區(qū)域。

顱骨開窗（關(guān)鍵步驟）：

使用精細(xì)顱骨鉆（<0.5 mm tip）在目標(biāo)腦區(qū)上方小心磨薄或打孔（通常 4–6 個孔，直徑 0.5–1 mm），避開主要血管?？孜桓鶕?jù)目標(biāo)腦區(qū)坐標(biāo)預(yù)先設(shè)計。用 PBS 沖洗碎屑，保持硬腦膜完整（或輕柔移除）。

安裝帶孔塑料成像窗口：

放置一個定制的帶孔塑料環(huán)（如聚醚醚酮 PEEK 或 Delrin 材料），孔位與探針路徑對齊。該窗口可穩(wěn)定腦組織、減少腦搏動，并防止探針插入時腦脊液流失。

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階段三：清醒狀態(tài)下探針插入與記錄

頭部固定：

將小鼠輕柔放入行為裝置，用頭架夾具固定頭部，身體置于泡沫墊或跑步球上。

探針裝載與定位：

將最多 6 根 Neuropixels 探針（如 NP 1.0 或 2.0）裝載到高精度微操縱器

通過顯微鏡或攝像頭對準(zhǔn)顱骨開孔，緩慢下降探針至硬腦膜表面。

探針插入：

以 10–50 μm/s 的速度緩慢插入探針至目標(biāo)深度。插入過程中小鼠應(yīng)保持安靜（可通過獎勵或習(xí)慣化實現(xiàn)）。

電生理記錄：

連接探針開始采集寬頻信號（通常 30 kHz 采樣率）。同步記錄行為視頻、跑步球運動、視覺刺激等。

階段四：數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與探針回收

實時監(jiān)測噪聲水平、單位數(shù)量、LFP 特征，確保信號質(zhì)量。記錄結(jié)束后緩慢回撤探針，清潔并妥善保存。

關(guān)鍵優(yōu)化點：

顱骨開窗面積大但精準(zhǔn)：平衡多探針通路與腦穩(wěn)定性。

硬腦膜處理：保留可減少炎癥，移除可降低插入阻力，需根據(jù)經(jīng)驗選擇。

清醒適應(yīng)訓(xùn)練：小鼠必須平靜。

虛擬現(xiàn)實模擬相關(guān)范式

頭部固定小鼠能夠?qū)崿F(xiàn)對神經(jīng)元活動的高分辨率監(jiān)測并結(jié)合對環(huán)境刺激的精確控制。虛擬現(xiàn)實可用于在頭部固定狀態(tài)下模擬運動時的視覺體驗，而一種低慣性的、可浮動的真實物理環(huán)境即“移動家園籠”（Mobile Home Cage, MHC）可調(diào)動更多感官模態(tài)，為復(fù)雜行為任務(wù)提供更豐富的實驗場景。

Fig2 基于氣浮技術(shù)的清醒行為記錄系統(tǒng)

(a) 頭部固定裝置：氣浮支撐的碳纖維容器置于空氣分配平臺上的頭部固定橋下方。

(b) 頭部固定裝置示意圖（左）：小鼠頭部被固定在橋上，但可通過自身運動帶動下方容器自由移動；實際照片顯示裝有泡沫T型迷宮插件的容器（右）。

(c) 小鼠在從飼養(yǎng)籠轉(zhuǎn)移至頭部固定裝置過程中，用法蘭絨布包裹以減少應(yīng)激。

(d) 頭部固定夾持器以37°傾角安裝，符合小鼠自然姿勢。

(e) 連續(xù)多日限水對小鼠體重的影響：藍(lán)色表示自由飲水期，灰色表示限水期。

(f) 在連續(xù)多日的15分鐘實驗中，每只小鼠完成的試驗次數(shù)（即圓形跑道的圈數(shù)）

采用立體定位手術(shù)在實驗前一周為小鼠植入頭件。手術(shù)中，小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后固定于立體定位儀，在Bregma與Lambda之間切開皮膚暴露顱骨，用3%過氧化氫清潔表面并以Vetbond膠將皮膚邊緣固定于顱骨以減少術(shù)后收縮。隨后輕劃顱骨以增強粘附力。在背側(cè)海馬上方鉆取直徑1.5 mm的顱骨開窗電生理實驗中該窗口以瓊脂封堵；最后，以牙科丙烯酸樹脂將頭板及導(dǎo)管整體穩(wěn)固于顱骨。術(shù)后小鼠先單籠飼養(yǎng)48小時，再恢復(fù)至常規(guī)雙籠環(huán)境繼續(xù)休養(yǎng)3–5天。從術(shù)后第5天起，開始為期數(shù)日的清醒頭部固定適應(yīng)訓(xùn)練。每日進(jìn)行15分鐘手法接觸：通過籠內(nèi)熟悉的紙筒隧道溫和取出小鼠，用手掌托持并允許其探索；隨后將其放入Mobile Home Cage（MHC）系統(tǒng)的碳纖維圓形arena中自由活動5分鐘。當(dāng)小鼠能主動返回實驗員手掌后，次日引入轉(zhuǎn)移布巾訓(xùn)練將其置于布巾上反復(fù)包裹/展開數(shù)次（每次<20秒）。達(dá)到穩(wěn)定配合后，正式進(jìn)入頭部固定階段：小鼠被布巾包裹后置于MHC系統(tǒng)中，該系統(tǒng)由鋁制支架和氣浮支撐的超輕碳纖維容器（直徑34 cm）組成。頭板被夾緊于頭柱，移除布巾后啟動空氣壓縮機（噪音約50 dB），調(diào)節(jié)氣壓使平臺懸浮高度剛好容許一張紙通過。實驗中可通過更換泡沫插件切換跑道構(gòu)型（如圓形或T迷宮）并在周圍設(shè)置條紋、斑點等視覺線索輔助空間定位。所有頭部固定實驗連續(xù)多日進(jìn)行，單次時長不超過20分鐘，確保動物在清醒、低應(yīng)激狀態(tài)下完成神經(jīng)記錄或行為任務(wù)。

雙光子成像中小鼠頭部固定

對清醒小鼠在雙光子顯微鏡下的高分辨率、長期穩(wěn)定成像：

1. 頭架手術(shù)植入

成年小鼠（8–12周齡）經(jīng)異氟烷麻醉后，固定于立體定位儀。沿顱骨中線切開皮膚，將定制鈦合金頭板（其連接桿位于顱骨后方并抬高，避免遮擋小鼠±59.3°水平與±47°垂直視野）以快干膠初步粘附，并用牙科丙烯酸樹脂牢固固定于頂骨與額骨。若需長期成像，在目標(biāo)腦區(qū)（如視覺皮層或海馬）上方鉆取直徑約3–5 mm的顱骨開窗，小心保留或移除硬腦膜，并覆蓋玻璃蓋片密封。術(shù)后給予鎮(zhèn)痛藥，單籠恢復(fù)48小時后轉(zhuǎn)為常規(guī)飼養(yǎng)，恢復(fù)期不少于5天。

2. 清醒適應(yīng)與行為訓(xùn)練

從術(shù)后第5天起，每日進(jìn)行10–15分鐘的溫和接觸與頭部固定適應(yīng)訓(xùn)練：通過隧道或手掌轉(zhuǎn)移小鼠，逐步引入包裹布巾和碳纖維跑輪環(huán)境，使其在無應(yīng)激狀態(tài)下習(xí)慣被固定于頭柱上并能在低慣性跑輪上自由運動。訓(xùn)練持續(xù)3–5天，直至小鼠在固定狀態(tài)下呼吸平穩(wěn)、主動探索且無掙扎行為。

3. 頭部固定與雙光子成像對準(zhǔn)

實驗當(dāng)日，將小鼠輕柔包裹后置于雙光子顯微鏡的行為平臺，通過夾具將頭板牢固夾持于預(yù)校準(zhǔn)的頭柱上。系統(tǒng)采用統(tǒng)一的“小鼠–屏幕”幾何構(gòu)型確保刺激顯示器位于標(biāo)準(zhǔn)視角范圍內(nèi)。為實現(xiàn)跨日精準(zhǔn)復(fù)位，所有成像系統(tǒng)均基于一個集成頭架接口的校準(zhǔn)標(biāo)尺進(jìn)行配準(zhǔn)：該標(biāo)尺永久嵌入頭架內(nèi)，位于目標(biāo)成像深度且垂直于光軸。

4. 機械穩(wěn)定性驗證

系統(tǒng)設(shè)計要求成像區(qū)域沿光學(xué)軸（z軸）總位移≤4?μm。通過計算機仿真與臺架測試（懸掛20–100?g砝碼）確認(rèn)頭架在0.5?N負(fù)載下中心撓度≤3.2?μm?；铙w測試中，在小鼠主動奔跑期間實時監(jiān)測顱窗位移，結(jié)果顯示最大瞬時位移≤2.2?μm，全程總位移≤3.3?μm，完全滿足雙光子鈣成像對穩(wěn)定性的嚴(yán)苛要求。

在清醒、行為活躍狀態(tài)下對同一神經(jīng)元群體進(jìn)行功能成像

實驗步驟：

本步驟旨在以最小化腦組織移動的方式植入用于頭部固定的頭板，必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作以防感染；建議使用5–6周齡小鼠（雄雌均可），且進(jìn)行膜片鉗記錄時年齡不超過12周，因年長動物顱骨增厚、腦組織特性改變易導(dǎo)致開顱困難、記錄成功率下降及接入電阻升高。

手術(shù)開始前以異氟烷麻醉小鼠，通過呼吸頻率和足趾夾捏反射確認(rèn)麻醉深度，雙眼涂眼科凝膠防干燥，置于加熱墊保溫并將頭部牢固固定于立體定位儀。隨后剃除頭頂被毛、消毒，并在切口周圍皮下注射局部鎮(zhèn)痛藥（如利多卡因/羅哌卡因）。沿顱骨輪廓切除圓形皮膚，徹底刮除頂骨與間頂骨表面及顱縫處的骨膜軟組織（殘留會導(dǎo)致頭板松動；可用生理鹽水濕潤以助識別），再用組織粘合劑封閉皮膚邊緣。待顱骨干燥后，輕磨骨面（避開目標(biāo)區(qū)），沿顱縫涂3–4層組織粘合劑粘合骨片至無相對移動并覆蓋其余骨面。接著用組織粘合劑初步固定頭板，再以牙科水泥牢固包埋，覆蓋所有暴露顱骨（僅留目標(biāo)腦區(qū)）并在該區(qū)域周圍構(gòu)筑1–2 mm高記錄腔壁（用于放置AgCl接地電極及微電極通道）；

若頭板為金屬須確保腔內(nèi)金屬完全被水泥覆蓋以實現(xiàn)電絕緣。最后以Kwik-Cast硅膠密封開顱區(qū)，皮下注射全身鎮(zhèn)痛藥并在術(shù)后48小時內(nèi)持續(xù)鎮(zhèn)痛、提供濕糧。術(shù)后進(jìn)入行為訓(xùn)練與習(xí)慣化階段：每日將小鼠頭部固定于實驗裝置中最多1小時，直至其表現(xiàn)規(guī)律運動（如跑輪奔跑）和舒適體態(tài)（尾巴下垂、無身體扭曲），期間可同步訓(xùn)練特定頭部固定行為任務(wù)。

寬場成像頭部固定

首先，在實驗前至少7天完成慢性顱骨窗植入手術(shù)確保小鼠（通常為5–8周齡C57BL/6J或表達(dá)GCaMP等鈣指示劑的轉(zhuǎn)基因品系）充分恢復(fù)；從術(shù)后第3–5天起開始行為習(xí)慣化訓(xùn)練，每日用法蘭絨布溫和包裹小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)移并逐步引入短時間（5–10分鐘）的頭部固定于行為平臺，隨后逐漸延長至30–60分鐘，直至小鼠表現(xiàn)出安靜呼吸、自發(fā)跑輪運動、尾巴自然下垂且無掙扎或過度理毛等應(yīng)激行為，通常需5–7天完成適應(yīng)。實驗當(dāng)日，將實驗室環(huán)境控制在安靜、柔和光照和22–24°C室溫條件下，提前開啟寬場成像系統(tǒng)、行為記錄設(shè)備（如跑輪旋轉(zhuǎn)編碼器、眼動追蹤及全身攝像系統(tǒng)）以及視覺刺激顯示器并進(jìn)行預(yù)熱與校準(zhǔn)。輕柔地從飼養(yǎng)籠中取出小鼠，用法蘭絨布包裹以減少應(yīng)激迅速轉(zhuǎn)移至成像平臺。將小鼠頭部牢固夾持于標(biāo)準(zhǔn)化頭柱夾具中，確保鈦合金頭板與夾具完全貼合、無松動；同時調(diào)整身體支撐結(jié)構(gòu)（如泡沫墊或氣浮式移動家籠），使小鼠可在固定狀態(tài)下自由奔跑，尾部自然下垂。校準(zhǔn)“小鼠-屏幕”幾何關(guān)系（距離15–20 cm，雙眼正對中心）確保視角一致。以皮層血管為參照對焦同步記錄跑輪、行為視頻及刺激。

動物頭部固定行為實驗裝置核心在于實現(xiàn)清醒、行為活躍狀態(tài)下穩(wěn)定、長期的神經(jīng)記錄或成像，同時通過受控的運動方式維持動物自然的感覺-運動交互。與自由活動范式不同，該方法通過固定頭部來提供高分辨率神經(jīng)技術(shù)（如雙光子顯微鏡、電生理記錄或?qū)拡龀上瘢┧匦璧臋C械穩(wěn)定性，同時允許動物通過自由旋轉(zhuǎn)的跑輪、氣浮球面平臺或線性軌道等方式主動參與行為任務(wù)。

關(guān)鍵設(shè)計原則：

1. 剛性頭部固定：通過手術(shù)將定制頭板牢固植入顱骨，再與實驗平臺上的夾具精確對接，確保在數(shù)小時乃至數(shù)周的實驗中頭部位移控制在微米級，滿足光學(xué)或電生理記錄對穩(wěn)定性的嚴(yán)苛要求。

2. 自然運動保留：盡管頭部被固定，大鼠仍可通過四肢驅(qū)動低慣性跑輪或在氣浮球上行走，產(chǎn)生真實的本體感覺、觸覺和運動輸出，從而維持接近自然狀態(tài)下的神經(jīng)動力學(xué)（如運動調(diào)制、空間導(dǎo)航相關(guān)活動）。

3. 多模態(tài)行為整合：系統(tǒng)通常集成視覺/聽覺刺激呈現(xiàn)、舔水獎勵裝置、觸須刺激器、眼動追蹤及全身視頻監(jiān)控，支持復(fù)雜感知-決策-動作閉環(huán)任務(wù)（如辨別任務(wù)、工作記憶或運動學(xué)習(xí)）。

4. 長期可重復(fù)性：借助標(biāo)準(zhǔn)化頭架接口和跨日空間配準(zhǔn)（例如使用校準(zhǔn)標(biāo)尺或血管圖譜），可在同一動物、同一腦區(qū)進(jìn)行連續(xù)數(shù)周至數(shù)月的縱向觀測，適用于發(fā)育、學(xué)習(xí)、疾病進(jìn)展或干預(yù)療效研究。

總結(jié)

動物頭部固定行為裝置并非簡單限制動物自由，而是一種平衡了實驗精度與行為生態(tài)效度的先進(jìn)神經(jīng)科學(xué)平臺，為在細(xì)胞或環(huán)路水平解析清醒大腦如何在主動行為中處理信息提供了強大工具。

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