2019 年底首次發(fā)現(xiàn)的新冠病毒（SARS-CoV-2）引起COVID-19（新型冠狀病毒肺炎）大流行，并迅速演變成一場(chǎng)全球性的公共衛(wèi)生危機(jī)。 SARS-CoV-2 是一種單股正鏈 RNA 病毒，其表面的刺突蛋白（spike，S）負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒的膜融合，也是疫苗設(shè)計(jì)的主要靶標(biāo)。SARS-CoV-2通過其包膜脂質(zhì)雙層與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合，從而啟動(dòng)對(duì)宿主細(xì)胞的感染。為克服膜融合過程中存在的顯著動(dòng)力學(xué)能壘，S蛋白會(huì)從一種亞穩(wěn)態(tài)的融合前構(gòu)象重折疊為能量更低、更加穩(wěn)定的融合后構(gòu)象。S 蛋白在合成后首先在一個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)被切成 S1 和 S2 兩個(gè)亞基；但在膜融合發(fā)生之前，推測(cè)S蛋白還需要在第二個(gè)切割位點(diǎn)（即S2′位點(diǎn)）被一種跨膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2進(jìn)一步切割，S2′位點(diǎn)的切割對(duì)于病毒膜融合和病毒感染入侵非常重要，但其確切的影響機(jī)制尚不清楚。

近期，來自哈佛醫(yī)學(xué)院/波士頓兒童醫(yī)院的Bing Chen課題組（共同一作、共同通訊石偉）在《自然·通訊》（Nature Communications）上在線發(fā)表了題為“Effect of the S2′ site cleavage on SARS-CoV-2 spike”的研究論文。該研究報(bào)道了S2′位點(diǎn)切割后的 S2 片段的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)很可能代表一種晚期膜融合中間態(tài)構(gòu)象；此外，功能實(shí)驗(yàn)表明S2′ 位點(diǎn)的切割可增強(qiáng)膜融合過程，其作用機(jī)制可能是通過穩(wěn)定膜融合中間態(tài)來實(shí)現(xiàn)的。這些研究結(jié)果加深了對(duì) SARS-CoV-2入侵宿主細(xì)胞機(jī)制的理解，并為針對(duì)致病性冠狀病毒的干預(yù)策略提供理論依據(jù)。

為評(píng)估S2′位點(diǎn)切割對(duì)結(jié)構(gòu)的影響，建立了一套制備 S2′ 位點(diǎn)被完全切割的 S2 片段（S2′片段）的方法。在制備 S2′片段時(shí)，首先將穩(wěn)定表達(dá) C 端帶有 Strep 標(biāo)簽的全長(zhǎng)S蛋白的細(xì)胞與可溶性 ACE2蛋白 孵育，隨后用胰蛋白酶處理，通過親和層析進(jìn)行純化，獲得了完整的 S2′片段。該片段的完整性通過 N 端測(cè)序以及 Western blot 檢測(cè) C 端標(biāo)簽得以確認(rèn)。純化后的S2′片段呈現(xiàn)出類似融合后構(gòu)象的特征性棒狀形態(tài)，既可以單個(gè)三聚體形式存在，也可以形成由 2 或 3 個(gè)三聚體組成的簇狀結(jié)構(gòu)。

利用冷凍電鏡的方法，解析了分辨率大概為3.1 ? 的S2′片段三聚體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)類似融合后構(gòu)象的S2蛋白三聚體，其核心結(jié)構(gòu)由 HR1、HR2、CH 和 3H 螺旋組成（圖 1a、1b），與此前報(bào)道的融合后S蛋白結(jié)構(gòu)幾乎完全一致。S1/S2-S2′小片段在S2′位點(diǎn)切割后已不再與S2其余部分形成共價(jià)連接（圖 1a），但該小片段仍然與三聚體緊密結(jié)合在一起。與此前發(fā)表的融合后 S2 結(jié)構(gòu)相比，該結(jié)構(gòu)最顯著的差異出現(xiàn)在包含膜相互作用片段的一端——即融合肽和跨膜區(qū)（圖 1c）。融合肽簇及其鄰近結(jié)構(gòu)的局部三重對(duì)稱軸相對(duì)于三聚體其余部分的三重對(duì)稱軸傾斜約25°。有意思的是，三條 TM 螺旋及其 N 端相鄰的HR2片段呈側(cè)向伸展，而不是圍繞融合肽簇分布；其中來自三個(gè)亞基中兩個(gè)的S816-834片段進(jìn)一步穩(wěn)定了這種側(cè)向伸展�？傮w而言，該結(jié)構(gòu)表明S2′位點(diǎn)切割并不顯著影響融合肽的位置，且S1/S2-S2′片段在切割后不會(huì)從三聚體中解離。 此外，還從同一數(shù)據(jù)以及另一個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)中獲得了一個(gè)低分辨率的結(jié)構(gòu)，顯示兩個(gè)S2′片段三聚體通過其融合肽的疏水相互作用形成二聚體（圖 2）。

圖1. 新冠病毒刺突蛋白 S2′片段在晚期膜融合中間態(tài)構(gòu)象下的結(jié)構(gòu)

圖2. S2′片段通過融合肽的疏水作用形成二聚體的密度圖及原子模型

此前，研究人員通過點(diǎn)突變對(duì)S蛋白的 S2′切割位點(diǎn)進(jìn)行了研究，但這些突變對(duì)融合前三聚體穩(wěn)定性的影響并未得到充分討論。該研究將S蛋白中的Arg815突變?yōu)樗衅渌赡艿陌被幔渲性S多替換突變?cè)诓挥绊懘掏坏鞍妆磉_(dá)水平、但會(huì)阻斷 TMPRSS2 或胰蛋白酶對(duì)S2′位點(diǎn)切割的情況下，仍然能夠高效支持細(xì)胞-細(xì)胞融合（圖 3a），表明Arg815 有助于穩(wěn)定融合前構(gòu)象，但涉及該殘基的S2′位點(diǎn)特異性切割并非膜融合所必需，而Arg815的突變都會(huì)完全消除 TMPRSS2 介導(dǎo)的膜融合增強(qiáng)效應(yīng)（圖 3b），提示 TMPRSS2 對(duì)S2′位點(diǎn)的切割是增強(qiáng)細(xì)胞表面膜融合所必需的。當(dāng)這些突變構(gòu)建在病毒樣顆粒（VLP）體系中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，TMPRSS2仍然能夠增強(qiáng) VLP 的感染性（圖 3c）。其中，多種 S 蛋白突變體（R815F、R815L、R815H、R815Q 和 R815W）能夠高效地?fù)饺?VLP，并表現(xiàn)出與野生型S蛋白相當(dāng)?shù)母腥灸芰Γ▓D 3c）。對(duì)于其余所有仍具有融合活性的突變體，不論S2′位點(diǎn)或者furin位點(diǎn)二者是否發(fā)生突變，其 VLP 感染性均表現(xiàn)出 TMPRSS2 依賴性的增強(qiáng)效應(yīng)（圖 3c）。TMPRSS2 對(duì) VLP 感染性的增強(qiáng)作用可能通過內(nèi)吞體進(jìn)入途徑實(shí)現(xiàn)，并不依賴于S2′位點(diǎn)的切割，與發(fā)生在細(xì)胞表面的膜融合過程形成鮮明對(duì)比。

圖3. S2′切割位點(diǎn)突變的影響

本研究加深了對(duì) SARS-CoV-2 膜融合入侵過程的認(rèn)識(shí)，并為防控致病性冠狀病毒的干預(yù)策略提供理論依據(jù)。

哈佛醫(yī)學(xué)院/波士頓兒童醫(yī)院的Wei Shi（石偉）、GM Jonaid和Md Golam Kibria為本文共同第一作者。哈佛醫(yī)學(xué)院/波士頓兒童醫(yī)院的Bing Chen和Wei Shi（石偉）為本文共同通訊作者。

招賢納士（博士后招聘）

目前，石偉已回國(guó)全職加入武漢大學(xué)，團(tuán)隊(duì)現(xiàn)招聘博士后，真誠歡迎對(duì)科研抱有激情、樂于團(tuán)隊(duì)合作的博士畢業(yè)生加入。課題組主要從事重要人類病毒膜融合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究以及設(shè)計(jì)針對(duì)膜融合過程的疫苗和藥物。請(qǐng)應(yīng)聘者將個(gè)人簡(jiǎn)歷發(fā)送至13429888598@163.com或shiwei@whu.edu.cn，郵件請(qǐng)注明“應(yīng)聘博士后崗位”。