【寫在前面】：近日，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所青蒿素研究中心道地藥材質(zhì)量保證與可持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院團(tuán)隊(duì)在Phytomedicine發(fā)表研究 論文《

Covalent Targeting GAPDH by Pudilan Formula and Baicalein Suppresses Macrophage Warburg Effect to Alleviate Acute Lung Injury

【期刊簡(jiǎn)介】

【題目及作者信息】

Covalent Targeting GAPDH by Pudilan Formula and Baicalein Suppresses Macrophage Warburg Effect to Alleviate Acute Lung Injury

背景

急性肺損傷（ALI）是一種嚴(yán)重的炎癥綜合征，其特征是巨噬細(xì)胞活化和細(xì)胞因子釋放失調(diào)，導(dǎo)致高死亡率。中藥方蒲地藍(lán)（PDL）已被證明對(duì)包括急性肺損傷在內(nèi)的炎癥性疾病具有臨床療效。然而，其多組分的復(fù)雜性掩蓋了其抗炎作用的精確分子靶點(diǎn)和機(jī)制。

目的

本研究旨在系統(tǒng)地鑒定PDL的直接蛋白靶點(diǎn)，并闡明其在ALI中抗炎作用的機(jī)制基礎(chǔ)。

方法

我們采用基于半胱氨酸反應(yīng)活性的蛋白質(zhì)譜（ABPP）化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)策略來(lái)繪制巨噬細(xì)胞中PDL的共價(jià)靶標(biāo)。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ABPP、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移測(cè)定（CETSA）、酶活性測(cè)定、生物層干涉法（BLI）和分子對(duì)接驗(yàn)證了靶點(diǎn)參與和功能影響。使用代謝通量分析（Seahorse）、細(xì)胞因子譜和體外和體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的炎癥模型評(píng)估功能后果。

結(jié)果

ABPP確定甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）是PDL的主要共價(jià)靶標(biāo)，在其催化半胱氨酸殘基（Cys150）處進(jìn)行了特異性修飾。黃芩素（BC）被確定為負(fù)責(zé)GAPDH參與的主要生物活性成分。PDL和BC都與GAPDH Cys150共價(jià)結(jié)合，抑制其酶活性。從功能上講，這種抑制抑制抑制了糖酵解通量（沃伯格效應(yīng)），促進(jìn)了巨噬細(xì)胞向氧化磷酸化（OXPHOS）的代謝轉(zhuǎn)變，并逆轉(zhuǎn)了促炎M1極化。這種代謝重編程在功能上與抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。關(guān)鍵的是，PDL和BC都減輕了小鼠ALI模型中LPS誘導(dǎo)的肺損傷，肺組織中證實(shí)了GAPDH參與和抑制的直接證據(jù)。

結(jié)論

我們的研究將GAPDH確立為PDL及其活性成分BC的直接共價(jià)靶標(biāo)，定義了PDL改善ALI的新“代謝免疫”軸。ABPP驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)反卷積策略克服了傳統(tǒng)中醫(yī)機(jī)理研究的局限性。這些發(fā)現(xiàn)為PDL的抗炎功效提供了機(jī)制基礎(chǔ)，并為炎性肺損傷提供了有針對(duì)性的治療策略。

圖文摘要

【前言】

急性肺損傷（ALI）是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，其特征是炎癥失調(diào)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)過(guò)度釋放、肺泡毛細(xì)血管屏障破壞、非心源性肺水腫和難治性低氧血癥。雖然敗血癥是主要誘因，但創(chuàng)傷和誤吸等其他損傷也可能引發(fā)這種情況。ALI的發(fā)病機(jī)制是由不受控制的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的，通常進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），在嚴(yán)重的情況下，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征。這一進(jìn)展與接近40%的高死亡率有關(guān)，使ALI/ARDS成為重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)學(xué)的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。目前的治療策略在很大程度上仍然是支持性的，強(qiáng)調(diào)肺保護(hù)性機(jī)械通氣、液體限制和根本原因的管理（例如，膿毒癥的抗生素）。然而，仍然嚴(yán)重缺乏直接針對(duì)核心病理機(jī)制的藥理學(xué)干預(yù)，即失調(diào)的肺部炎癥和內(nèi)皮/上皮損傷?，F(xiàn)有的抗炎療法顯示出有限的臨床療效，并且通常具有很大的風(fēng)險(xiǎn)，包括對(duì)繼發(fā)感染的易感性增加。同樣，對(duì)于急性肺損傷（ALI）的其他癥狀，如炎癥加重對(duì)肺泡上皮和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮的損傷、彌漫性肺泡和間質(zhì)水腫以及進(jìn)行性低氧血癥，也沒有特效藥物。因此，急性肺損傷的整體治療結(jié)果仍然非常令人不滿意。迫切需要專門針對(duì)急性肺損傷的安全有效的抗炎藥物。

中藥方劑代表了一種治療炎癥性疾病的獨(dú)特治療范式，以其“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”協(xié)同調(diào)節(jié)的內(nèi)在能力而聞名。與傳統(tǒng)的單一靶點(diǎn)藥物相比，中藥配方利用不同生物活性成分的聯(lián)合作用來(lái)調(diào)節(jié)復(fù)雜炎癥網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。這種多藥物策略能夠?qū)崿F(xiàn)更全面和平衡的抗炎反應(yīng)，有可能克服與單一療法相關(guān)的療效限制和耐藥性。蒲地蘭消炎口服液（PDL）是一種經(jīng)典的中藥制劑，由黃芩、蒲公英、板藍(lán)根和延胡索組成，體現(xiàn)了這種方法。PDL在臨床和臨床前研究中均顯示出對(duì)呼吸道和肺部炎癥的顯著療效。然而，盡管PDL具有治療前景，但其更廣泛的臨床應(yīng)用仍受到兩大挑戰(zhàn)的阻礙：作用機(jī)制（MOA）不明確和直接分子靶點(diǎn)不明。破譯這種復(fù)雜的多組分配方的目標(biāo)仍然是一個(gè)重大障礙。目前的中藥靶點(diǎn)鑒定策略主要依賴于基于親和力的技術(shù)，包括親和力超濾質(zhì)譜（AUF-MS）、生物分子配體固定（BLI）、多靶點(diǎn)蛋白質(zhì)捕撈和熱蛋白質(zhì)組分析（TPP）。這些方法受到幾個(gè)關(guān)鍵限制的約束，例如中藥成分的化學(xué)復(fù)雜性、在生理相關(guān)系統(tǒng)中的適用性有限、依賴先驗(yàn)知識(shí)導(dǎo)致的選擇偏差以及檢測(cè)共價(jià)相互作用的靈敏度不足。

【結(jié)果部分】

1.PDL可減輕LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

2.基于半胱氨酸反應(yīng)活性的蛋白質(zhì)譜分析鑒定RAW264.7巨噬細(xì)胞中PDL靶蛋白。

3.PDL共價(jià)靶向Cys150位點(diǎn)的 GAPDH 并抑制其酶活性。

4.靶向PDL的抗炎活性成分篩選 GAPDH。

5.黃芩素（BC）可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

6.黃芩素共價(jià)結(jié)合 GAPDH 的Cys150位點(diǎn)并抑制其酶活性。

7.BC通過(guò)抑制LPS激活的巨噬細(xì)胞中的Warburg效應(yīng)來(lái)減輕炎癥反應(yīng)。

8.PDL及其活性成分BC通過(guò)抑制小鼠炎癥風(fēng)暴緩解急性肺損傷。

9.示意圖闡釋了中藥復(fù)方蒲地藍(lán)（PDL）及其活性成分黃芩素（BC）通過(guò)靶向抑制 GAPDH 和重編程巨噬細(xì)胞代謝來(lái)緩解急性肺損傷（ALI）的作用機(jī)制。

【結(jié)論與討論】

總之，本研究揭示了中藥方蒲地蘭（PDL）及其核心黃酮黃芩素（BC）抗炎功效的新機(jī)制。我們證明PDL和BC都共價(jià)靶向甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的催化半胱氨酸殘基Cys150，從而抑制其酶活性。這種抑制作用破壞了活化巨噬細(xì)胞中的沃伯格效應(yīng)，將細(xì)胞代謝從糖酵解轉(zhuǎn)移到氧化磷酸化。這種代謝重編程共同逆轉(zhuǎn)促炎M1極化，抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，抑制關(guān)鍵炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，最終改善小鼠急性肺損傷

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