核受體4A1（NR4A1，也稱(chēng)為Nur77，TR3）是必需的核受體超家族成員。新興證據(jù)表明NR4A1是炎癥和增殖的雙重調(diào)節(jié)因子，對(duì)腎臟病理生理學(xué)有重要影響。然而，它在MsPGN相關(guān)炎癥和MCs增殖中的作用尚不明確。截至目前，尚未發(fā)現(xiàn)NR4A1的明確內(nèi)源性配體，因此將其命名為孤兒受體。然而，一些小分子化合物——例如Cytosporone B (CsnB)——已被證明可以結(jié)合NR4A1的LBD并調(diào)節(jié)其活性。因此，鑒定可以結(jié)合NR4A1的天然小分子配體具有重要意義。

Bruceine A （BA）是一種從鴉膽子中提取的天然化合物，具有與MsPGN致病因子一致的生物活性。除了其在糖尿病腎病中的抗炎作用外，BA還具有獨(dú)特的抗病毒特性和雙重抗腫瘤作用然而，其調(diào)節(jié)MCs炎癥和增殖的能力仍未被探索。

2025年12月5日，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)證候國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室潘胡丹/劉良院士團(tuán)隊(duì)、中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心腎內(nèi)科陳香美院士在STTT（IF 52.7）發(fā)表題為“Bruceine A protects nuclear receptor 4A1 from ubiquitin-degradation to alleviate mesangial proliferative glomerulonephritis”的文章。鴉膽子苦素 A（BA）與 NR4A1 的 D481/Q568 位點(diǎn)結(jié)合，并在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出 NR4A1 依賴(lài)性的抗炎和抗增殖作用。BA 與 NR4A1 的 LBD 結(jié)合（通過(guò) D481/Q568），從而在 K558 處通過(guò)空間位阻阻止 K48 連接的多泛素化，并穩(wěn)定 NR4A1 蛋白水平。這種穩(wěn)定使 NR4A1 能夠自激活其啟動(dòng)子，增強(qiáng) NF-κB 的轉(zhuǎn)錄抑制，最終減弱炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和系膜增生，從而賦予腎臟保護(hù)作用。

摘要

核受體 4A1（NR4A1）在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并參與多種疾病過(guò)程；然而，其在系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）中的功能作用和藥理學(xué)潛力尚未得到探索。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) NR4A1 的下調(diào)通過(guò)調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞（MCs）的炎癥和增殖反應(yīng)來(lái)促進(jìn) MsPGN 的發(fā)病機(jī)制，而 NR4A1 的過(guò)表達(dá)則會(huì)逆轉(zhuǎn)這些過(guò)程。鴉膽子苦素A（BA）與 NR4A1 的 D481/Q568 位點(diǎn)結(jié)合，并在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出 NR4A1 依賴(lài)性的抗炎和抗增殖作用。值得注意的是，腺相關(guān)病毒 9 型（AAV9）介導(dǎo)的 NR4A1 過(guò)表達(dá)可減輕腎小球損傷和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而敲除 NR4A1 則會(huì)削弱 BA 的腎保護(hù)作用。BA 與 NR4A1 的配體結(jié)合域（LBD）結(jié)合，并進(jìn)一步通過(guò)空間阻斷 K48 聯(lián)合多聚泛素化在 K558 位點(diǎn)處阻斷，從而穩(wěn)定 NR4A1 蛋白水平。這種穩(wěn)定狀態(tài)使得 NR4A1 能夠自動(dòng)激活自身的啟動(dòng)子，增強(qiáng)核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路磷酸化的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而最終抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和系膜細(xì)胞增殖，實(shí)現(xiàn)腎臟保護(hù)。這項(xiàng)研究為開(kāi)發(fā)針對(duì)膜性腎小球腎炎的下一代療法提供了一條有前景的治療途徑。

BA通過(guò)抑制K48連接的多泛素化在K558來(lái)穩(wěn)定NR4A1，從而改善MsPGN。 (左) 在病理?xiàng)l件下，K48連接的多泛素化介導(dǎo)NR4A1的降解，從而影響其自調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。隨后的NF-κB激活促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子釋放和MCs增殖，加重腎損傷。 (右) BA抑制K48連接的多泛素化在K558，穩(wěn)定NR4A1。這恢復(fù)了NR4A1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄自放大和NF-κB抑制，減輕炎癥和系膜增生，從而提供腎臟保護(hù)

1.NR4A1 下調(diào)通過(guò)調(diào)節(jié)MC中的炎癥和增殖反應(yīng)來(lái)促進(jìn)IgAN的進(jìn)展

NR4A1在IgAN進(jìn)展中作為一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，通過(guò)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)和增殖反應(yīng)來(lái)促進(jìn)發(fā)病機(jī)制。

圖1 NR4A1的下調(diào)通過(guò)調(diào)節(jié)MC中的炎癥和增殖反應(yīng)來(lái)促進(jìn)IgAN的進(jìn)展

2.NR4A1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了 MC 的炎癥反應(yīng)和增殖

NR4A1過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制系膜炎癥和增殖來(lái)減緩疾病進(jìn)展。

圖2 NR4A1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了MCs的炎癥反應(yīng)和增殖

3.BA與NR4A1結(jié)合親和力高，并形成緊密的相互作用

為了識(shí)別與NR4A1結(jié)合的候選化合物，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥（TCM）數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)中選擇了超過(guò)20種腎保護(hù)化合物進(jìn)行分子對(duì)接分析。分子對(duì)接結(jié)果表明，BA理論上對(duì)NR4A1表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合親和力（親和力?=??8.00?kcal/mol），并且像CsnB一樣，結(jié)合在NR4A1的同一口袋內(nèi)。具體來(lái)說(shuō)，BA在NR4A1的LBD中與谷氨酰胺568 (Q568) 和天冬氨酸481 (D481) 形成多達(dá)四個(gè)氫鍵，表明增強(qiáng)的結(jié)合穩(wěn)定性（圖3a）。

為了進(jìn)一步確認(rèn)BA是否與NR4A1結(jié)合，我們?cè)隗w外進(jìn)行了CETSA和DARTS實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，BA以劑量依賴(lài)的方式保護(hù)NR4A1免受蛋白水解和高溫降解（圖3b, c）。同時(shí)，人類(lèi)蛋白質(zhì)組微陣列篩選獨(dú)立驗(yàn)證了NR4A1作為BA結(jié)合靶點(diǎn)（圖3d）。值得注意的是，我們還使用SPR、MST和BLI實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了BA和NR4A1之間的結(jié)合親和力。MST結(jié)果顯示出Kd值為12.42?±?1.55?μM（圖3e），而SPR和BLI分析分別顯示出Kd值為3.62?×?10?? M和9.69?×?10???M（圖3f) 為了確定BA-NR4A1的結(jié)合特異性，我們根據(jù)對(duì)接預(yù)測(cè)生成了NR4A1突變體（D481A和Q568A），并進(jìn)行了MST和SPR實(shí)驗(yàn)。顯著的是，D481A/Q568A突變顯著降低了結(jié)合親和力，MST Kd增加到204.83?±?17.06?μM（圖3g）和SPR Kd增加到3.84?×?10???M（圖3h），確認(rèn)這些殘基為關(guān)鍵的相互作用位點(diǎn)。總之，這些結(jié)果表明BA結(jié)合在NR4A1 LBD的D481和Q568。

圖3 BA與NR4A1具有高親和力并形成緊密的相互作用

4.BA通過(guò)NR4A1減輕抗thy1大鼠腎炎模型的蛋白尿和病理改變

圖4 BA對(duì)蛋白尿和病理變化的影響

5.BA通過(guò)NR4A1/NF-κB信號(hào)通路抑制MCs增殖和炎癥

圖5 BA在體外抑制MCs的增殖和炎癥

6.BA在體外以競(jìng)爭(zhēng)性方式與CsnB結(jié)合到NR4A1上并且在體內(nèi)

圖6 BA以競(jìng)爭(zhēng)性方式與CsnB結(jié)合于體外和體內(nèi)NR4A1

7.BA 緩解依賴(lài) NR4A1 的抗 Thy1 腎炎

圖7 BA依賴(lài)于NR4A1緩解抗thy1腎炎

8.BA通過(guò)抑制K48連接的多泛素化修飾來(lái)穩(wěn)定NR4A1，從而賦予腎臟保護(hù)作用

圖8 BA通過(guò)抑制K48連接的泛素化修飾K558來(lái)穩(wěn)定NR4A1，從而提供腎保護(hù)

結(jié)論

我們證明了天然化合物BA通過(guò)特異性抑制K48連接的泛素化在K558，從而穩(wěn)定NR4A1并抑制NF-κB驅(qū)動(dòng)的炎癥來(lái)賦予腎臟保護(hù)作用。重要的是，我們建立了一種“蛋白質(zhì)穩(wěn)定化”的治療模式，超越了傳統(tǒng)的受體激活策略，解決了經(jīng)典N(xiāo)R4A1激動(dòng)劑的局限性。這些發(fā)現(xiàn)不僅推進(jìn)了我們對(duì)核受體在腎病中調(diào)控的理解，還為在其他病理?xiàng)l件下靶向蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)提供了框架，為開(kāi)發(fā)新的腎病藥物提供了新的見(jiàn)解。

https://www.nature.com/articles/s41392-025-02495-2

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