大家好，今天分享一篇在著名期刊International Journal of Biological Macromolecules上發(fā)表“Emerging nutritional potential of edible-medicinal homologous coix lacryma-jobi seed-derived exosomes for treatment of ulcerative colitis”的研究論文。

簡(jiǎn)短版

植物來源的外泌體因其對(duì)多種炎癥性疾病的顯著治療潛力而引起了廣泛的研究興趣。本研究從薏苡仁種子中分離出外泌體（CLS-Exos），并系統(tǒng)評(píng)估了其在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠模型中的治療效果。通過密度梯度離心成功分離出CLS-Exos，獲得的顆粒平均直徑為157 nm，zeta電位為-0.098 mV。這些CLS-Exos表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性，并能有效抑制活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。值得注意的是，CLS-Exos處理顯著下調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6，同時(shí)上調(diào)抗炎介質(zhì)IL-10和細(xì)胞保護(hù)酶血紅素氧合酶-1（HO-1）。因此，CLS-Exos給藥改善了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎主要癥狀，包括體重減輕、疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）增加、結(jié)腸縮短和結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)損傷?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明CLS-Exos通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，將平衡從促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡缀托迯?fù)狀態(tài)，從而減輕實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。

詳細(xì)版

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是慢性炎癥性腸病（IBD）的主要形式，造成重大且日益增長(zhǎng)的全球健康負(fù)擔(dān)。UC的病理特征包括彌漫性、表淺性和連續(xù)性黏膜炎癥。UC的確切病因和發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。它被認(rèn)為是由遺傳易感性、免疫失調(diào)和環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用引起的。已確定的風(fēng)險(xiǎn)因素包括陽性家族史、慢性吸煙和高脂肪飲食。常見的臨床表現(xiàn)包括腹瀉、腹痛和便血（大便帶血）。在嚴(yán)重情況下，該疾病可導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，如腸穿孔、危及生命的出血，以及長(zhǎng)期結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加。UC通常呈復(fù)發(fā)緩解型病程。這種慢性和不可預(yù)測(cè)的性質(zhì)顯著損害患者的生活質(zhì)量，在最嚴(yán)重的表現(xiàn)中可能危及生命。

UC的異質(zhì)性和復(fù)雜性給臨床管理帶來了重大挑戰(zhàn)。目前的治療選擇有限，主要涉及免疫抑制劑和生物制劑，其中包括已批準(zhǔn)的藥物，如5-氨基水楊酸（5-ASA）和抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體用于治療UC。然而，相當(dāng)比例的患者對(duì)可用的藥物治療無效，最終需要手術(shù)干預(yù)。

外泌體是由各種植物和動(dòng)物細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它們作為天然納米載體的固有特性賦予了優(yōu)異的生物相容性和組織穿透能力。因此，外泌體具有雙重功能：它們不僅是各種治療化合物的有效遞送載體，而且本身也作為內(nèi)在治療劑發(fā)揮作用。其中，植物外泌體（PENs）因其低毒性和強(qiáng)大的生物活性而引起了顯著關(guān)注。例如，Deng等人證明口服西蘭花來源的外泌體有效改善了模型中的急性和慢性炎癥性腸?。↖BD）。同樣，Huang等人報(bào)道生姜衍生的PENs作為UC靶向治療的有效遞送系統(tǒng)。作為一類新型生物活性納米載體，PENs在UC治療中顯示出相當(dāng)大的前景。隨著研究繼續(xù)揭示其作用機(jī)制，它們的治療價(jià)值日益得到認(rèn)可。PENs提供了傳統(tǒng)療法和動(dòng)物源外泌體的有前景替代方案，整合了幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：固有的生物相容性、可擴(kuò)展生產(chǎn)、低免疫原性和內(nèi)在靶向能力，從而為UC治療提供了新的戰(zhàn)略方向。

“藥食同源”概念源于傳統(tǒng)中醫(yī)，正在獲得全球認(rèn)可。這一范式強(qiáng)調(diào)使用飲食成分進(jìn)行健康維護(hù)和疾病預(yù)防，旨在最大限度地減少與長(zhǎng)期藥物使用相關(guān)的潛在不良反應(yīng)。支持這一概念的是，許多藥用植物已顯示出抗炎、抗癌和緩解COVID-19后綜合征的特性。事實(shí)上，飲食干預(yù)已被證明能有效管理多種疾病。例如，生酮飲食用于腎臟疾病、精神疾病和中老年人群心血管疾病。這種方法對(duì)消化 disorders特別相關(guān)，是全球最普遍的健康問題之一。值得注意的飲食策略包括地中海飲食用于兒科胃腸道問題，特定碳水化合物操作用于功能性疾病，以及無麩質(zhì)飲食用于炎癥性腸病（IBD）。

薏苡種子是一種有充分文獻(xiàn)記載的藥用和食用植物，在傳統(tǒng)飲食和醫(yī)學(xué)中已使用數(shù)百年?，F(xiàn)代證據(jù)證實(shí)其生物活性化合物的抗癌、抗炎、抗氧化和降血糖活性，支持這種歷史用途。特別是從薏苡中分離的特定生物活性成分薏苡素已顯示出顯著的抗炎特性和低細(xì)胞毒性。鑒于薏苡L.種子成分已確立的抗炎功效，我們假設(shè)從中衍生的一類新型生物活性納米顆?！曹臃N子來源外泌體（CLS-Exos）可能保留并傳遞這些治療特性。因此，我們推測(cè)CLS-Exos代表一種有前景的新型潰瘍性結(jié)腸炎治療候選物。我們的結(jié)果表明，CLS-Exos通過顯著下調(diào)關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-1β）的表達(dá)來改善潰瘍性結(jié)腸炎。據(jù)我們所知，本研究首次報(bào)道CLS-Exos的成功提取及其在UC管理中的治療應(yīng)用。總之，這些發(fā)現(xiàn)確立CLS-Exos作為一種有前景和有效的UC治療劑。CLS-Exos的提取及其對(duì)UC的影響如圖1所示。

3.1. CLS-Exos的表征

對(duì)CLS-Exos的理化性質(zhì)進(jìn)行了全面表征。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）顯示平均 hydrodynamic直徑為157±2.828 nm，zeta電位為-0.098±0.262 mV（圖2A-B）。雖然近中性zeta電位可能表明合成納米顆粒的不穩(wěn)定性，但低多分散指數(shù)（PDI為0.13）表明單分散分布，暗示在測(cè)量條件下的膠體穩(wěn)定性。這種現(xiàn)象與生物衍生納米顆粒一致，可能歸因于其復(fù)雜的表面組成和儲(chǔ)存緩沖液的離子強(qiáng)度。透射電子顯微鏡（TEM）形態(tài)學(xué)檢查證實(shí)存在均勻的杯狀囊泡，直徑約為150 nm（圖2C）。納米顆粒跟蹤分析（NTA）證實(shí)了尺寸分布并提供了顆粒濃度數(shù)據(jù)（圖2D）。

通過多個(gè)獨(dú)立批次驗(yàn)證了提取方案的重現(xiàn)性（圖2N）。代謝組學(xué)分析在CLS-Exos中鑒定出36種不同的脂質(zhì)種類（圖2E），主要包括甘油三酯（TG，22.5%）、神經(jīng)酰胺（CER，13.1%）、己糖基神經(jīng)酰胺（Hex1Cer，8.7%）和心磷脂（CL，9.7%）（圖2F）。小RNA測(cè)序顯示CLS-Exos miRNAs中存在長(zhǎng)度依賴性核苷酸偏倚（圖2G-H）。較短的miRNA（18-20 nt）富含鳥嘌呤（G:23-25%），而較長(zhǎng)的種類（22-25 nt）主要含有腺嘌呤（A:28-32%）和尿嘧啶（U:26-30%）。胞嘧啶（C）在所有長(zhǎng)度中均代表性不足（<20%）。值得注意的是，miR-159家族成員，特別是csi-miR159a-3p和gma-miR159e-3p，在表達(dá)最高的10種miRNA中占總TPM標(biāo)準(zhǔn)化讀數(shù)的22-35%（圖2I）。miRNA表達(dá)譜表現(xiàn)出樣品特異性異質(zhì)性（圖2J）。

CLS-Exos1顯示雙峰分布，具有明顯的低表達(dá)（中值TPM:120）和高表達(dá)（中值TPM:280）群體，表明潛在的功能特化或選擇性包裝。CLS-Exos2顯示右偏單峰分布（中值TPM:95），而CLS-Exos3表現(xiàn)出緊密聚集的譜（中值TPM:130），共同表明95-280 TPM的表達(dá)范圍。功能注釋顯示跨數(shù)據(jù)庫（Port、Pram、GO和EggNOG）的多樣化基因映射，KEGG通路中的注釋較少（圖2K）。脂質(zhì)碳鏈分析顯示雙峰分布，在C16（120±15種脂質(zhì)）和C18（140±12種脂質(zhì)）處達(dá)到峰值（圖2L），突出了對(duì)膜完整性至關(guān)重要的棕櫚酸和硬脂酸衍生物的豐度。通過BCA測(cè)定確定的蛋白質(zhì)濃度為12.54μg/mL（圖2M）。

3.2. CLS-Exos的生物相容性

通過細(xì)胞毒性和血液相容性測(cè)定評(píng)估CLS-Exos的生物安全性。使用MTT測(cè)定在RAW264.7和NCM460細(xì)胞上評(píng)估細(xì)胞毒性。根據(jù)ISO 10993-5標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)細(xì)胞活力超過70%時(shí)，材料被認(rèn)為是非細(xì)胞毒性的。我們的結(jié)果證實(shí)，即使在最高濃度的CLS-Exos（3.04×1010顆粒/mL）下，兩種細(xì)胞系的活力仍保持在該閾值以上（圖3B）。

通過將小鼠紅細(xì)胞與各種濃度的CLS-Exos孵育來評(píng)估血液相容性（圖3C）。在治療組中未觀察到顯著溶血。定量而言，所有CLS-Exos濃度的溶血率保持在5%以下，這是生物材料廣泛接受的安全限度。這與陽性對(duì)照（0.1% Triton X-100）誘導(dǎo)的完全溶血和陰性對(duì)照（PBS）的可忽略背景形成鮮明對(duì)比。這些集體發(fā)現(xiàn)證明CLS-Exos的優(yōu)異生物相容性。

為了進(jìn)一步評(píng)估CLS-Exos給藥的體內(nèi)安全性概況，在C57BL/6小鼠中進(jìn)行了全面的系統(tǒng)評(píng)估。在適應(yīng)期后，給小鼠施用CLS-Exos，之后收集血液和主要器官進(jìn)行分析。血液生化分析（圖3D）和全血細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖3E-K）。初步安全性評(píng)估顯示，盡管與對(duì)照組相比某些參數(shù)觀察到微小變化，但所有值仍在既定的生理正常范圍內(nèi)，表明沒有臨床顯著毒性。組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步證實(shí)CLS-Exos的生物安全性。對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟等重要器官的蘇木精和伊紅（H&E）染色顯示與對(duì)照小鼠組織相比沒有結(jié)構(gòu)損傷、炎癥浸潤或其他病理改變的證據(jù)（圖3L）?？傊?，血液學(xué)、生化和組織病理學(xué)分析的結(jié)果表明CLS-Exos在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的安全性。

3.3. CLS-Exos對(duì)ROS和NO的清除能力

使用DCFH-DA熒光探針在H?O?刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞和NCM460細(xì)胞中評(píng)估CLS-Exos的活性氧（ROS）清除能力。在用H?O?誘導(dǎo)氧化應(yīng)激之前，用不同濃度的CLS-Exos預(yù)處理細(xì)胞。熒光顯微鏡成像顯示CLS-Exos預(yù)處理以劑量依賴性方式有效減弱H?O?誘導(dǎo)的兩種細(xì)胞類型中的ROS生成，較高濃度的CLS-Exos表現(xiàn)出優(yōu)異的ROS清除活性（圖4B-C）。這種定性觀察通過定量圖像分析得到證實(shí)。與表現(xiàn)出最強(qiáng)熒光信號(hào)的陽性對(duì)照（僅H?O?組）相比，CLS-Exos處理組的熒光強(qiáng)度顯著降低（圖4D-E）。這些結(jié)果共同證明CLS-Exos的強(qiáng)效抗氧化活性。

在LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中評(píng)估CLS-Exos抑制一氧化氮（NO）產(chǎn)生的能力。CLS-Exos處理以劑量依賴性方式顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放（圖4F）。與NO結(jié)果一致，培養(yǎng)上清液的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）顯示CLS-Exos深刻調(diào)節(jié)關(guān)鍵炎癥介質(zhì)的分泌。具體而言，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生以劑量依賴性方式顯著抑制（圖4G-I）。

3.4. CLS-Exos對(duì)腸上皮細(xì)胞修復(fù)的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)表明CLS-Exos以濃度和時(shí)間依賴性方式顯著增強(qiáng)NCM460腸上皮細(xì)胞的遷移（圖5A-B）。與對(duì)照相比，CLS-Exos處理組的傷口閉合率顯著更高，在最高濃度下觀察到最明顯的效果。這些結(jié)果表明CLS-Exos有效促進(jìn)腸上皮的恢復(fù)，表明它們可能促進(jìn)炎癥誘導(dǎo)的黏膜損傷修復(fù)的關(guān)鍵機(jī)制。

3.5. 口服CLS-Exos在DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎中的治療效果

建立右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠模型以評(píng)估CLS-Exos對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的治療效果。給小鼠隨意飲用含3% DSS的水7天以誘導(dǎo)結(jié)腸炎，然后在第8天恢復(fù)正常飲水。在第8至14天，治療組小鼠每天口服不同濃度的CLS-Exos懸浮液，而對(duì)照組接受磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)體重作為關(guān)鍵疾病參數(shù)。與健康空白對(duì)照相比，DSS模型對(duì)照組表現(xiàn)出顯著體重減輕。相反，所有CLS-Exos處理組以劑量依賴性方式顯示DSS誘導(dǎo)的體重減輕顯著減輕（圖6B）。高劑量CLS-Exos組顯示最明顯的保護(hù)作用，體重軌跡與模型對(duì)照組相比顯著接近正常水平。

使用疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）定量評(píng)估疾病活動(dòng)。如圖6C所示，DSS模型對(duì)照組表現(xiàn)出最高DAI評(píng)分，而健康空白對(duì)照組在整個(gè)研究期間保持最低評(píng)分。CLS-Exos處理導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度的劑量依賴性改善，高劑量組顯示DAI評(píng)分接近健康對(duì)照組，低劑量組顯示中等保護(hù)。

我們進(jìn)一步評(píng)估了對(duì)器官重量和結(jié)腸形態(tài)的影響。主要器官（心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟）的分析顯示CLS-Exos處理以濃度依賴性方式減輕DSS誘導(dǎo)的器官重量變化，治療組的器官重量介于健康對(duì)照組（最高重量）和DSS模型對(duì)照組（最低重量）之間（圖6D-H）。

作為結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的關(guān)鍵指標(biāo)，結(jié)腸長(zhǎng)度評(píng)估顯示平行趨勢(shì)（圖6I）。DSS模型組表現(xiàn)出顯著的結(jié)腸縮短、壁增厚和隱窩結(jié)構(gòu)喪失。這些病理變化通過CLS-Exos處理顯著改善，特別是在高劑量組，其維持的結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)與健康對(duì)照組相當(dāng)（圖6J）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明CLS-Exos對(duì)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎具有強(qiáng)效、劑量依賴性的治療效果。

3.6. CLS-Exos治療后體內(nèi)炎癥因子表達(dá)

通過H&E染色對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析，以評(píng)估黏膜損傷程度和CLS-Exos的治療效果（圖7A）。與空白對(duì)照組中觀察到的健康結(jié)構(gòu)相比，3% DSS誘導(dǎo)模型組的結(jié)腸切片顯示嚴(yán)重的病理改變，包括廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤、隱窩扭曲和喪失，以及杯狀細(xì)胞耗竭。

CLS-Exos處理對(duì)這些DSS誘導(dǎo)的組織病理學(xué)損傷具有濃度依賴性保護(hù)作用。高劑量CLS-Exos組顯示結(jié)腸結(jié)構(gòu)幾乎完全保存，炎癥浸潤最小，隱窩維持良好。杯狀細(xì)胞的定量證實(shí)了這種修復(fù)效果，其顯示與施用的CLS-Exos濃度顯著正相關(guān)（圖7B）。相反，低劑量組顯示與DSS模型對(duì)照組相似的組織學(xué)特征，表明低濃度時(shí)療效有限。

為了闡明CLS-Exos在結(jié)腸炎中的治療機(jī)制，我們分析了全身和局部炎癥反應(yīng)。ELISA血清分析顯示CLS-Exos處理顯著調(diào)節(jié)關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子的全身水平。DSS模型組表現(xiàn)出最高濃度的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，而CLS-Exos給藥導(dǎo)致其水平的劑量依賴性降低，接近健康對(duì)照組中觀察到的水平（圖8A-C）。

結(jié)腸組織的定量PCR（qPCR）分析在轉(zhuǎn)錄水平顯示一致變化。促炎介質(zhì)（TNF-α、IL-1β和IL-6）的mRNA表達(dá)隨著CLS-Exos處理以濃度依賴性方式降低（圖8D-F）。相反，抗炎和細(xì)胞保護(hù)基因（包括IL-10和血紅素氧合酶-1（HO-1））的表達(dá)以劑量依賴性方式相應(yīng)增加（圖8G-H）?？傊?，這些結(jié)果表明CLS-Exos通過全身和局部恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)，有效抑制促炎信號(hào)，同時(shí)促進(jìn)抗炎和保護(hù)途徑，從而改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。

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