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Cardiology Plus | T7 RNA 聚合酶 II 類暫停位點對 mRNA 治療藥物的影響

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從疫苗到腫瘤免疫,再到心血管疾病治療,mRNA 藥物的應(yīng)用版圖正在迅速擴展。然而,mRNA 藥物的研發(fā)不僅依賴于蛋白質(zhì)編碼序列本身,更深層的“分子工藝學(xué)”問題往往決定了藥物的質(zhì)量和產(chǎn)量。

近期,Cardiology Plus 2025 年第二期發(fā)表了休斯頓衛(wèi)理公會醫(yī)院研究團隊的一項研究,他們關(guān)注到一個可能決定最終藥物的質(zhì)量和產(chǎn)量但常被忽視的細節(jié)——T7 RNA 聚合酶暫停位點(pause site)。本研究旨在表征 T7 RNAP II 類暫停位點及其對 mRNA 生產(chǎn)的影響,以優(yōu)化治療性 mRNA 的設(shè)計。

什么是暫停位點?

在體外轉(zhuǎn)錄(IVT)中,T7 RNA 聚合酶負責(zé)把 DNA 模板“抄寫”成 RNA。理想狀態(tài)下,它會一直復(fù)制到末端,生成完整的 mRNA。但如果遇到某些特殊序列,它會突然“剎車”,提前終止,這些暫停位點(pause sites)會產(chǎn)生流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄本(abortive transcripts)。這種流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物降低了 mRNA 原料藥中治療性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量;并可能激活先天免疫反應(yīng);和/或產(chǎn)生具有脫靶效應(yīng)的截短蛋白。

幾十年前,保守序列基序 ATCTGTT 被鑒定為內(nèi)源性 T7 RNA 聚合酶 (RNAP) II 類暫停位點。但是,人們并不完全了解這個暫停位點對 IVT 過程的影響。

最新研究發(fā)現(xiàn)了什么?

休斯頓衛(wèi)理公會醫(yī)院的團隊對多個 DNA 模板進行了系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn):


  • ATCTGTT 可能不足以在體外誘導(dǎo) T7 RNAP 轉(zhuǎn)錄終止。需要額外的下游核苷酸才能形成完整的 T7 RNAP II 類暫停位點:ATCTGTTtc、ATCTGTaaa、ATCTGTTta、ATCTGTTcc

  • 暫停位點越靠近轉(zhuǎn)錄后段,影響越大,截短比例更高

  • T7 RNAP 暫停位點顯著影響 mRNA 制造產(chǎn)量。


實驗亮點:突變讓 mRNA “滿血復(fù)活”

在一份名為“376”的序列模板中,原始版本會產(chǎn)生 25% 截短產(chǎn)物。但當(dāng)研究者用同義突變替換掉 ATCTGTTt 序列后,所有截短轉(zhuǎn)錄本消失,產(chǎn)率和完整性大幅提升。

類似地,在另一份“406”序列模板中,電泳圖顯示沒有流產(chǎn)峰,暫停位點的修飾讓mRNA產(chǎn)量從1.5 mg/mL提升到7.3 mg/mL。這意味著,簡單的堿基替換,就能將 mRNA 工藝效率提升近 5 倍


圖1. 對含有與不含 T7 RNA 聚合酶暫停位點的”376“模板所轉(zhuǎn)錄mRNA的分析


圖2. 對含有與不含 T7 RNA 聚合酶暫停位點的 406 條 mRNA 的分析

免疫反應(yīng):修飾比截短更關(guān)鍵

研究還關(guān)注了免疫原性。在采用N1-甲基偽尿苷修飾的mRNA處理后,不同模板的細胞因子釋放(如 IL-6)差異不大。這說明:


  • 暫停位點確實影響產(chǎn)量和純度;

  • 免疫原性主要由化學(xué)修飾決定,而非截短片段的多少。



圖5. nGFP mRNA的免疫原性

未來展望:mRNA 藥物設(shè)計的規(guī)則

這項研究給 mRNA 藥物研發(fā)帶來了幾個重要啟示:

1. DNA 模板設(shè)計要避開暫停序列

在設(shè)計開放閱讀框時,應(yīng)仔細檢查是否包含 ATCTGTT 及其變體。

2. 暫停效應(yīng)與位置相關(guān)

越靠近 3’ 端,越容易生成截短產(chǎn)物。設(shè)計時不僅要看序列,還要看“地理位置”。

3. 優(yōu)化產(chǎn)量與質(zhì)量的低成本策略

同義突變是一種高效而安全的手段,可避免截短產(chǎn)物而不改變蛋白序列。

4. 未來方向:酶學(xué)改造

部分改良型 T7 RNAP(如 K179C/M750C 突變體)能夠繞過暫停位點。這為工藝開發(fā)提供了另一種思路。

結(jié)語

隨著 mRNA 技術(shù)走出疫苗賽道,向心血管、代謝性疾病等慢病領(lǐng)域延伸,生產(chǎn)工藝的“隱形障礙”不容忽視。T7 RNA 聚合酶暫停位點,就像隱藏在 DNA 序列里的“暗礁”,一旦觸發(fā),可能讓整個生產(chǎn)過程效率大打折扣。

這項研究提醒我們:mRNA 藥物設(shè)計不僅是生物學(xué)問題,更是工程學(xué)問題。

在序列優(yōu)化、化學(xué)修飾與酶學(xué)改造的共同作用下,未來的 mRNA 藥物將更加安全、高效,為臨床治療帶來更多可能。

引用本文:Li, Linda Hongye1; Wang, Xiaoxiao1; Yan, Qing1; Gateway, Celetta G.1; Van Meter, Bennett1; Damase, Tulsi1; Liang, Yi1; Morales, Elisa1; Domingues Bueno, Murilo T.1; McRae, Ewan K.S.1; Cooke, John P.1,*. The impact of T7 RNA polymerase class II pause sites on mRNA therapeutics. Cardiology Plus 10(2):p 99-109, April-June 2025.

DOI: 10.1097/CP9.0000000000000123

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