急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一種惡性血液腫瘤, 其特征是骨髓中異常分化的髓系細胞不受控制地增殖和積累 [1] . 盡管初始治療可使大部分患者獲得緩解, 但高復發(fā)率仍是治療的主要挑戰(zhàn), 近半數(shù)的緩解患者最終會復發(fā). 理解AML的發(fā)病機制, 特別是導致白血病細胞異常分化和復發(fā)的關鍵調控紊亂, 對于開發(fā)更有效的治療策略至關重要.

造血過程是一個高度受控的連續(xù)分化過程, 由特定的轉錄程序精確調控 [2] . 該過程的失調可導致異常造血分化并最終引發(fā)白血病 [1] . 轉錄調控主要依賴于轉錄因子(transcription factor, TF)與基因組上特定的染色質開放區(qū)域( cis -regulatory elements, CREs)的結合, 從而激活或抑制下游基因的表達. 然而, 在AML中, 驅動關鍵調控紊亂的具體分子機制, 尤其是非編碼區(qū)突變的作用, 以及復發(fā)克隆的來源尚不完全清楚.

為了深入解析AML的發(fā)病機制, 本研究團隊應用了創(chuàng)新的單細胞多組學技術——線粒體單細胞染色質可及性測序 [3] (mitochondrial single-cell assay for transposase-accessible chromatin with sequencing mitochondria single-cell ATAC-seq, mtscATAC-seq), 結合單細胞RNA測序(single-cell RNA-seq, scRNA-seq)分析, 對AML患者的骨髓細胞進行了系統(tǒng)研究( 圖1 ). 該技術體系的核心優(yōu)勢在于能夠同時獲取單個細胞的染色質開放狀態(tài)、基因表達譜以及線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)突變信息, 從而在單細胞分辨率下解析腫瘤異質性、追蹤細胞譜系并關聯(lián)調控變化.

圖1 研究設計示意圖: 結合mtscATAC-seq和scRNA-seq解析AML發(fā)病機制. 圖片修改自參考文獻 [4]

研究團隊構建了高質量的正常人類造血單細胞多組學參考圖譜, 描繪了從造血干細胞到成熟髓系和淋系細胞分化過程中染色質可及性和基因表達的動態(tài)變化規(guī)律. 通過將AML腫瘤細胞映射到這一正常分化軌跡上, 研究人員能夠精確定位腫瘤細胞所對應的正常發(fā)育階段, 并識別其分化阻滯的位置. 研究發(fā)現(xiàn), 即使在形態(tài)學上看似分化的AML細胞中, 其染色質可及性模式已表現(xiàn)出顯著的早期調控異常.

研究團隊主要展示了三個方面的重要發(fā)現(xiàn). 其一是wilm腫瘤基因(wilms’ tumor gene 1, WT1)鋅指域突變破壞表觀遺傳調控. 在部分起源于造血早期階段的AML(如M4亞型患者)中, 高頻出現(xiàn)WT1鋅指結構域突變(如R467Q、R467L、R467W、H470Y、H470R). 該突變削弱WT1與表觀遺傳因子十十一易位蛋白2(ten-eleven translocation 2, TET2)的相互作用, 導致TET2無法被招募至靶基因調控區(qū), 從而引起啟動子/增強子DNA高甲基化、染色質可及性降低及基因沉默. 這些基因多富集于p53等腫瘤相關通路, 其沉默促進AML進展. 細胞實驗表明, 突變型WT1無法恢復靶基因的開放性與表達, 而野生型WT1可以 [5] .

其二是非編碼區(qū)突變創(chuàng)造新轉錄因子結合位點激活致癌基因. 在AML細胞中發(fā)現(xiàn)一個位于GATA結合蛋白4(GATA binding protein 4, GATA4)下游增強子區(qū)的C>A突變, 創(chuàng)造了新的CCAAT增強子結合蛋白β基因(CCAAT enhancer binding protein beta, CEBPB)結合位點. 該突變增強了CEBPB與增強子的結合, 提升染色質可及性并異常激活GATA4表達. 在KG-1a細胞中引入該突變可顯著促進增殖. GATA4在患者中高表達且與不良預后相關 [6] , 提示非編碼突變可通過重塑轉錄因子結合位點驅動白血病發(fā)生.

其三是利用mtDNA突變追蹤復發(fā)相關克隆. AML高復發(fā)與治療耐受的細胞亞群持續(xù)存在有關. 利用mtscATAC-seq同時捕獲的mtDNA突變作為天然條形碼, 可重建患者腫瘤細胞的譜系與克隆結構. 發(fā)現(xiàn)特定上層亞克隆(如AML7的克隆2)具有更高的LSC特征基因表達 [7] , 與已報道的復發(fā)相關細胞群高度相似. 基于這些克隆中特異高表達的27個基因建立的預測模型, 在治療應用研究以產生有效的治療方法項目(Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments, TARGET)隊列中較傳統(tǒng)方法有更高的復發(fā)預測受試者工作特征曲線下面積(area under the receiver operating characteristic curve, AUC) [8] , 且這些基因在耐藥細胞系中亦高表達, 提示其與化療抵抗相關.

綜上所述, 本研究通過整合創(chuàng)新的單細胞多組學技術(mtscATAC-seq、scRNA-seq)和 cis GRN生物信息學算法( cis -regulatory element gene regulon network, cis GRN), 系統(tǒng)揭示了AML發(fā)病和復發(fā)的新機制: 關鍵轉錄因子的功能獲得性或缺失性突變通過改變表觀遺傳景觀調控下游基因表達; 基因組非編碼區(qū)突變通過創(chuàng)造新的轉錄因子結合位點異常激活致癌基因(如GATA4); 利用細胞內源性mtDNA突變作為條形碼, 成功追蹤到具有干細胞特征和耐藥潛能的復發(fā)相關克隆, 并鑒定了其特異性分子標志物. 這些發(fā)現(xiàn)不僅深化了對AML分子發(fā)病機制的理解, 為開發(fā)靶向表觀遺傳調控或克服耐藥的精準治療策略提供了新思路和新靶點, 同時也為利用單細胞多組學技術和天然細胞條形碼研究其他復雜疾病的異質性和進化規(guī)律提供了重要范式.

參考文獻

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[2] Velten L, Haas S F, Raffel S, et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process . Nat Cell Biol , 2017 , 19: 271 -281

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