本期推薦的是由華北理工大學藥學院、河北省慢性疾病重點實驗室、河北工業(yè)大學健康科學與生物醫(yī)學工程學院等研究團隊合作近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示淫羊藿苷通過cGAS - STING通路減輕神經炎癥從而緩解認知功能障礙。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Icariin alleviates cognitive dysfunction by reducing neuroinflammation via the cGAS-STING pathway

民族藥理學相關性
淫羊藿是一種中草藥，以其補腎功效而聞名。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有多種藥理特性，但其對阿爾茨海默病的影響尚需進一步探索。

研究目的
本研究旨在探討淫羊藿苷通過環(huán)狀GMP-AMP合成酶-干擾素基因刺激因子通路對阿爾茨海默病神經炎癥的抑制作用。

材料與方法
采用SPF級雄性ICR小鼠，通過側腦室注射Aβ1-42建立AD模型。通過行為學測試、病理學評估、免疫熒光染色、分子對接和蛋白質印跡分析，評估ICA治療對小鼠記憶功能、神經元損傷、神經炎癥以及cGAS-STING通路的影響。

結果
ICA能顯著改善AD小鼠的記憶障礙，減輕神經元損傷和細胞凋亡，并抑制神經炎癥。此外，ICA抑制了小膠質細胞的過度活化，促進了其從M1表型向M2表型的轉化。它特異性抑制了cGAS-STING通路的激活，并下調了cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-IRF3/IRF3和p-NF-κB/NF-κB的表達。此外，分子對接顯示，ICA與cGAS的結合能為-7.07 kcal/mol，表明兩者存在穩(wěn)定的相互作用。使用cGAS選擇性小分子抑制劑RU.521進行的進一步驗證，證實了ICA通過cGAS-STING信號通路對小膠質細胞表型轉化和神經炎癥的保護作用。

結論
ICA通過cGAS-STING通路抑制小膠質細胞表型轉化和神經炎癥，在AD中展現(xiàn)出治療潛力，使其成為靶向該通路的AD候選治療藥物。

圖文摘要

【前言】

阿爾茨海默?。ˋD）是一種進行性神經系統(tǒng)疾病，主要損害語言、記憶、認知和行為能力。AD的主要病理特征包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化產生的神經原纖維纏結。淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為，Aβ寡聚體在神經元突觸處的過度產生和聚集會誘導氧化應激、神經炎癥、細胞凋亡以及隨后的神經退行性變。目前可用的AD治療方法主要針對癥狀管理，無法改變疾病的根本進程。因此，迫切需要關注能夠預防或治療AD的藥物研發(fā)。

隨著對AD研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，神經炎癥是該疾病病理生理學的關鍵因素。作為中樞神經系統(tǒng)（CNS）主要的免疫細胞群，小膠質細胞深度參與神經炎癥過程，并負責清除神經元周圍的細胞碎片和廢物。尤其重要的是，小膠質細胞具有生物物理獨立性，它們參與CNS活動需要進行大量的結構重塑。在神經炎癥過程中，小膠質細胞能夠感知環(huán)境變化并發(fā)生形態(tài)轉化，這對于其CNS功能至關重要。在健康的大腦中，小膠質細胞呈現(xiàn)分枝狀形態(tài)，其特征是胞體小，具有眾多突起，包括適量的初級分支和廣泛分支的次級及三級突起，每個突起末端呈微小的錐形尖端。這些分枝狀的小膠質細胞被認為是"靜息狀態(tài)"，在此期間，它們的分枝突起通過直接接觸或分泌介質，持續(xù)不斷地與神經元和其他膠質細胞相互作用。當CNS受損時，小膠質細胞被激活，伴隨著形態(tài)從靜息的分枝狀態(tài)向阿米巴狀態(tài)的轉變。根據(jù)激活表型，小膠質細胞可分為M1和M2表型。前者表現(xiàn)出細胞毒性，而后者則具有神經保護特性。當M1型小膠質細胞被激活時，會產生促炎細胞因子，如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和活性氧（ROS）。在AD的病理過程中，Aβ和tau蛋白的特異性及過度磷酸化會觸發(fā)小膠質細胞的M1型促炎反應，導致神經元細胞死亡并產生關鍵炎性細胞因子。相反，M2樣反應性小膠質細胞可以通過吞噬作用減輕Aβ和tau的積累。近期研究表明，通過調節(jié)小膠質細胞的激活狀態(tài)和神經炎癥信號通路，可以改善包括AD在內的神經系統(tǒng)疾病的預后。

環(huán)狀GMP-AMP合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激因子（STING）通路構成了一種關鍵的胞質DNA感知機制，能夠觸發(fā)炎性細胞因子的產生，同時也參與誘導細胞凋亡。cGAS作為主要的胞質DNA傳感器，能夠識別外源性和內源性的異常雙鏈DNA（dsDNA）。識別后，cGAS發(fā)生結構重排，催化鳥苷三磷酸（GTP）和腺苷三磷酸（ATP）反應，生成2‘3’-環(huán)狀GMP-AMP（cGAMP）。cGAMP作為第二信使，與位于內質網（ER）上的銜接蛋白STING結合。當cGAMP與STING結合后，會引起構象變化，使得STING更容易從內質網轉運到高爾基體進行激活。隨后，STING招募TANK結合激酶1（TBK1），從而啟動核因子κB（NF-κB）和干擾素調節(jié)因子3（IRF3）的轉錄通路。這一級聯(lián)反應最終導致炎性細胞因子和I型干擾素的釋放，從而加劇炎癥反應、免疫失調和神經元損失。值得注意的是，已有研究證實cGAS-STING通路在神經退行性疾病的發(fā)生中起作用。先前研究已證明，cGAS-STING通路通過刺激小膠質細胞并促進促炎細胞因子的釋放，導致神經炎癥和認知障礙。因此，抑制cGAS以緩解神經炎癥，成為AD一種潛在有效的治療策略。

淫羊藿是淫羊藿屬的一種被子植物。作為一種中草藥，其藥用價值在《神農本草經》中已有記載，并被廣泛認為具有補腎壯陽、強筋健骨以及祛風濕的功效。根據(jù)中醫(yī)理論，AD與腎虛、脾虛、氣血不足、痰濕阻絡、血瘀等因素有關，這與淫羊藿的傳統(tǒng)功效相吻合。淫羊藿苷（ICA）是從淫羊藿中提取的一種關鍵黃酮類化合物，具有穿過血腦屏障（BBB）的能力，并展現(xiàn)出多種藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡和免疫調節(jié)活性。研究表明，ICA對AD表現(xiàn)出顯著的神經保護作用，具體體現(xiàn)在減少β-淀粉樣蛋白沉積、改善氧化應激狀態(tài)、促進突觸可塑性、抑制神經元凋亡以及緩解認知障礙。此外，ICA已被證明能有效減少脂多糖（LPS）在BV2細胞系中誘導的神經炎癥。然而，盡管ICA具有巨大的治療潛力，但仍需進一步的深入研究和驗證，以闡明其是否可能通過調節(jié)cGAS-STING信號通路來抑制神經炎癥的具體機制。

在本研究中，我們初步評估了ICA對由Aβ1-42誘導的AD小鼠模型的學習記憶能力和神經炎癥的潛在益處。此外，我們研究了ICA對cGAS-STING通路的影響，并利用cGAS選擇性小分子抑制劑RU.521進一步驗證了ICA對cGAS-STING誘導的小膠質細胞活化所引發(fā)神經炎癥的保護作用。這項研究表明ICA在治療AD方面可能具有潛力，從而為該領域未來的研究和開發(fā)奠定了堅實的基礎。

【結果部分】

1. ICA改善AD小鼠的學習記憶障礙

圖1. ICA對AD小鼠學習記憶能力的影響。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=12）。(A) 動物實驗設計時間線。該圖使用Biorender.com平臺創(chuàng)建，協(xié)議編號：QU27CAW222。(B) 各組小鼠的游泳軌跡。(C) 小鼠在Morris水迷宮中連續(xù)5天尋找隱藏平臺的平均潛伏期。(D) 空間探索試驗中穿越平臺的次數(shù)。(E) 空間探索試驗中小鼠在目標象限的探索時間。(F) 新物體識別實驗中的相對識別指數(shù)。(G) Y迷宮實驗中小鼠的自發(fā)交替率。

2.ICA減輕AD小鼠的神經元損傷。

圖2. ICA對AD小鼠神經元損傷的影響。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A，C）H&E染色的典型顯微照片，包括CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域（A，H&E染色，400倍）；全海馬圖像完整顯示右側海馬組織，其中三個矩形框分別標示CA1、CA3和DG區(qū)域（C，H&E染色，100倍）。（B，D）尼氏染色的代表性圖像，包括CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域（B，尼氏染色，400倍）；全海馬圖（D，尼氏染色，100倍）。（E）CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域尼氏小體的定量分析結果。

3.ICA減少AD小鼠的細胞凋亡。

圖3. ICA對AD小鼠細胞凋亡的影響。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A）TUNEL染色代表性圖片（TUNEL染色，200倍）。（B）海馬CA1、CA3和DG區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)量（C）Bcl-2和Bax的代表性蛋白條帶。（D）Bcl-2的標準化表達量。（E）Bax的標準化表達量。（F）Bcl-2/Bax比值。

4.ICA減輕AD小鼠神經炎癥反應并調節(jié)小膠質細胞活化。

圖4. ICA對AD小鼠神經炎癥及小膠質細胞活化的抑制作用。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A、B）促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）表達結果。（C、D）抗炎因子（IL-4和IL-10）表達結果。（E）Iba1免疫熒光染色代表性圖像（Iba1免疫熒光染色，200×）。（F）Iba1、CD16和Arg1蛋白的代表性條帶。（G）Iba1標準化表達量。（H）CD16標準化表達量。（I）Arg1標準化表達量。

5.ICA對cGAS-STING通路的影響。

圖5. ICA抑制AD小鼠cGAS-STING信號通路活化。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A）cGAS、STING、p-TBK1、TBK1、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IRF3和IRF3的代表性蛋白條帶。（B-F）cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65及p-IRF3/IRF3的標準化表達量。（G）ICA與cGAS分子對接實驗結果。

6.ICA高劑量通過抑制cGAS-STING通路減輕神經炎癥。

圖6. ICA高劑量通過抑制cGAS-STING信號通路改善AD小鼠認知障礙和神經元損傷。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（MWM實驗n=12，H&E和尼氏染色n=3）。(A) 各組小鼠游泳軌跡典型示意圖。(B) 小鼠在Morris水迷宮中連續(xù)5天尋找隱藏平臺的潛伏期。(C) 空間探索試驗中穿越平臺的次數(shù)。(D) 空間探索試驗中小鼠在目標象限的探索時間。(E) 海馬CA1、CA3、DG及皮層區(qū)域尼氏小體定量分析。(F) H&E染色典型顯微圖像，顯示CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域（H&E染色，400倍）；全海馬圖像完整顯示右側海馬組織，三個矩形框分別標示CA1、CA3和DG區(qū)域（H&E染色，100倍）。(G) 尼氏染色代表性圖像，顯示CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域（尼氏染色，400倍）；全海馬圖像（尼氏染色，100倍）。

圖7. ICA高劑量通過抑制cGAS-STING信號通路減輕AD小鼠神經炎癥并抑制小膠質細胞活化。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A、B）促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）表達結果。（C、D）抗炎因子（IL-4和IL-10）表達結果。（E）Iba1免疫熒光染色典型圖像（Iba1免疫熒光染色，200×）。（F）Iba1、CD16和Arg1蛋白的代表性條帶。（G）Iba1標準化表達量。（H）CD16標準化表達量。（I）Arg1標準化表達量。

圖8. ICA高劑量抑制AD小鼠cGAS-STING信號通路活化。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A）cGAS、STING、p-TBK1、TBK1、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IRF3和IRF3的代表性蛋白條帶。（B-F）cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65及p-IRF3/IRF3的標準化表達量。（G,H）海馬區(qū)和皮層區(qū)域cGAS（紅色）與Iba1（綠色）雙重免疫熒光染色代表性圖像，細胞核經DAPI（藍色）復染（cGAS與Iba1雙重免疫熒光染色，200×）。

7.機制圖。

【結論與討論】

阿爾茨海默病是一種與年齡相關的常見神經退行性疾病，其中Aβ沉積和tau蛋白過度磷酸化是其病理生理學的關鍵指標。在中樞神經系統(tǒng)中，包括小膠質細胞和星形膠質細胞在內的神經膠質細胞是神經炎癥的主要介導者，在神經退行性疾病中具有至關重要的作用。越來越多的實驗證據(jù)表明，Aβ沉積會激活小膠質細胞，從而啟動神經炎癥，最終導致神經元凋亡和認知功能下降。cGAS-STING信號通路是一條經典的炎癥通路。ICA是一類源自天然的異戊烯化黃酮類化合物，具有多種生物學效應，如抗炎、抗氧化和神經保護特性。值得注意的是，研究表明ICA能增加小鼠CA3區(qū)的尼氏體數(shù)量，并增強AD小鼠模型的學習記憶能力。然而，ICA治療AD的潛在機制仍不明確。在本研究中，我們提供的證據(jù)表明，ICA能改善AD小鼠的病理變化并提高其認知功能。此外，我們觀察到AD小鼠腦中cGAS顯著升高，這與神經炎癥有關。使用RU.521特異性抑制cGAS，通過抑制STING和NF-κB相關的炎性細胞因子，顯著減輕了炎癥反應?？傊?，我們的研究結果表明，ICA可通過調節(jié)cGAS-STING信號通路抑制神經炎癥，從而改善認知功能障礙。

神經炎癥在包括AD在內的多種神經退行性疾病中起著關鍵作用。在大腦中，cGAS-STING通路主要在小膠質細胞中表達，并觸發(fā)干擾素反應。小膠質細胞激活后會產生神經毒性物質，最終導致腦損傷。實際上，小膠質細胞在幾種神經退行性疾病中表現(xiàn)出不同的表型并被激活。先前的研究將活化的小膠質細胞分為M1和M2型以反映其功能多樣性。穩(wěn)態(tài)下的小膠質細胞呈現(xiàn)高度分枝的形態(tài)，但激活后會發(fā)生諸如胞體增大、突起縮短等變化，并極化為M1或M2表型，以特定標記物為特征。由于多奈哌齊已被證明能有效減輕神經炎癥和細胞凋亡，因此在本研究中被用作陽性對照藥物。我們的研究重點評估了小膠質細胞的激活狀態(tài)、形態(tài)以及炎癥因子表達。值得注意的是，在ICA治療組中，Iba1和CD16的表達顯著降低，而Arg1的表達則明顯增加。此外，ICA給藥導致小鼠腦組織中促炎細胞因子減少，而抗炎細胞因子增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，ICA能夠減輕Aβ1-42誘導的炎癥反應和小膠質細胞活化，這與先前的文獻報道一致。此外，ICA對神經炎癥的抑制作用可能歸因于其能夠抑制小膠質細胞的過度活化，同時促進其從M1表型向M2表型轉化。另外，ICA能有效減少Aβ1-42引起的神經元凋亡，這可能是由于其能夠阻止活化的小膠質細胞產生炎性細胞因子。

外源性和異常定位的內源性DNA可引發(fā)先天免疫反應。先前研究已確定cGAS是一種主要識別胞質DNA的關鍵模式識別受體。cGAS與胞質DNA結合后被激活，并促進cGAMP的產生，隨后觸發(fā)STING及其下游效應蛋白TBK1。這種激活級聯(lián)導致IRF3和NF-κB等轉錄因子發(fā)生核轉位，進而引發(fā)干擾素和炎癥基因的表達。越來越多的證據(jù)支持cGAS-STING通路在神經退行性疾病的小膠質細胞介導的神經炎癥中發(fā)揮作用。cGAS-STING通路能夠激活NF-κB依賴性信號轉導，這對于調節(jié)促炎細胞因子的轉錄以及包括細胞凋亡在內的多種細胞生物學過程至關重要。細胞凋亡可通過外源性或內源性途徑進行調節(jié)，其中內源性途徑的激活與DNA損傷、缺血和氧化應激等多種刺激密切相關。Bcl-2家族蛋白是內源性凋亡的核心，其中Bcl-2維持細胞存活，而Bax則激活凋亡途徑。最近研究表明，STING可以激活NF-κB信號級聯(lián)，并且siRNA p65介導的NF-κB信號阻斷能顯著減少STING誘導的細胞凋亡和衰老，同時改善STING介導的細胞外基質代謝失衡。我們的結果表明，在Aβ1-42誘導的AD小鼠腦組織中，cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IRF3/IRF3的表達水平均升高，而ICA干預逆轉了這種升高。分子對接研究還發(fā)現(xiàn)ICA與cGAS之間存在顯著的結合親和力。小膠質細胞在受到刺激后可以發(fā)生極化，采用促炎或抗炎表型。已發(fā)現(xiàn)cGAS-STING通路的異常激活與細胞凋亡有關。在我們的研究中，觀察到ICA通過抑制cGAS-STING通路來減輕神經炎癥。這種抑制導致小膠質細胞的促炎極化減少，隨后炎性細胞因子的釋放也減少。通過緩解促炎微環(huán)境，ICA有助于減輕神經系統(tǒng)內的炎癥環(huán)境。此外，這種抑制作用還降低了炎性介質對神經元的毒性作用，從而降低了神經元凋亡的風險。值得注意的是，RU.521是一種有效的選擇性cGAS抑制劑，它通過血腦屏障發(fā)揮神經保護作用，并對神經元凋亡、小膠質細胞活化和小膠質細胞形態(tài)變化產生有益影響。我們的結果顯示，單獨使用RU.521或RU.521聯(lián)合ICA-H治療的小鼠，上述蛋白的表達顯著降低，并且這些治療與單獨使用ICA-H相比無顯著差異。此外，cGAS和Iba1的共定位分析顯示，cGAS主要在海馬和皮層的小膠質細胞中表達。這些數(shù)據(jù)突顯了ICA通過cGAS-STING通路減輕神經炎癥，從而改善AD相關認知功能下降的潛力。

在本研究中，我們以神經炎癥為重點考察了ICA的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，ICA能促進小膠質細胞從M1表型向M2表型轉化，從而減輕由小膠質細胞過度活化引起的神經炎癥反應。此外，ICA通過阻止cGAS-STING信號通路的激活來抑制炎性細胞因子的表達。值得注意的是，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，隨著cGAS-STING通路的激活，NF-κB的表達水平也同步增加。然而，我們的研究存在一些局限性。首先，經典的STING-IRF3-I型干擾素通路在AD中的作用尚未完全闡明。其次，尚未評估這些通路在其他細胞類型中的調節(jié)潛力，因此值得進一步研究。最后，本研究觀察到ICA可能通過兩種協(xié)同機制發(fā)揮調節(jié)作用：ICA通過直接與cGAS結合來抑制其功能活性，從而阻斷cGAS-STING信號通路的激活；ICA可能通過促進cGAS蛋白降解或抑制其表達來降低細胞內cGAS蛋白水平，從而從源頭上阻止通路激活。這兩種機制可能協(xié)同作用，共同構成了ICA調節(jié)cGAS-STING通路的分子基礎。未來的實驗將進一步研究ICA降低cGAS蛋白水平的能力與其通過直接結合與cGAS蛋白相互作用的機制之間的關聯(lián)。

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