腫瘤異質(zhì)性是治療過程中出現(xiàn)耐藥和免疫逃逸的關(guān)鍵驅(qū)動因素。傳統(tǒng)治療在殺傷效率、系統(tǒng)毒性等之間始終難以取得平衡。近年來，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑、過繼性細(xì)胞療法為代表的免疫治療策略，通過重編程宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)持久的免疫記憶效應(yīng)，成為繼手術(shù)、放化療之后，惡性腫瘤系統(tǒng)治療的新基石。

免疫治療的療效高度依賴靶點(diǎn)的精準(zhǔn)遴選；CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）基因組篩選技術(shù)，基于CRISPR基因編輯技術(shù)，憑借其高通量、高保真和可編程優(yōu)勢，已成為從基因庫中系統(tǒng)鑒定廣譜、高效且低毒性免疫靶點(diǎn)的核心手段。因此，系統(tǒng)性總結(jié)CRISPR篩選技術(shù)在腫瘤免疫研究中應(yīng)用的進(jìn)展，能夠?yàn)閺氖履[瘤和免疫學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)和臨床科學(xué)家提供一定的理論指導(dǎo)。

近日，浙江大學(xué)良渚實(shí)驗(yàn)室侯宇、郭紅山團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)通報(bào)》發(fā)表了題為“CRISPR篩選技術(shù)在腫瘤免疫研究中的最新進(jìn)展”的評述文章，聚焦CRISPR篩選技術(shù)在腫瘤免疫治療中的前沿應(yīng)用，系統(tǒng)闡述其對免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高通量基因功能篩選，從而精準(zhǔn)鎖定調(diào)控腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸的關(guān)鍵分子，進(jìn)一步揭示腫瘤-免疫互作新機(jī)制，為優(yōu)化免疫療法并促進(jìn)個性化精準(zhǔn)治療奠定了基礎(chǔ)。

文章完整呈現(xiàn)了CRISPR篩選從基礎(chǔ)編輯工具到多模態(tài)整合技術(shù)的迭代路徑，從簡單對基因組進(jìn)行敲除（CRISPR knockout）、敲降（CRISPRi）或過表達(dá)（CRISPRa）到實(shí)現(xiàn)對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（Perturb-seq、CRISP-seq和CROP-seq）、蛋白組（Perturb-CITE-seq）及代謝組層面同時捕獲信息，從而深入研究基因?qū)?xì)胞表型的多維影響。CRISPR 篩選技術(shù)可進(jìn)一步與原位測序和高通量成像技術(shù)（如光學(xué)混合篩選技術(shù)）以及成像空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Perturb-FISH）等相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對基因擾動的高分辨率時空分析。

依托CRISPR篩選技術(shù)多層次的信息讀取能力，腫瘤免疫研究進(jìn)入了新的發(fā)展階段。將CRISPR篩選技術(shù)應(yīng)用到免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，解析出驅(qū)動腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵信號節(jié)點(diǎn)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)化現(xiàn)有免疫治療策略。文章系統(tǒng)總結(jié)了CRISPR篩選在免疫細(xì)胞中的應(yīng)用，進(jìn)一步涵蓋了NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等缺乏關(guān)注的免疫亞群，并歸納出利用CRISPR篩選的研究范式。

圖1 CRISPR篩選流程示意圖

針對人原代 T 細(xì)胞的體外篩選歷來難度較大；隨著 CRISPR 敲除、CRISPRa、CRISPRi、堿基編輯和RNA編輯等一系列篩選平臺相繼成熟，研究者已順利鑒定出 BATF3、鉛靶蛋白PRODH2 等調(diào)控免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，并闡明了輔助性T細(xì)胞命運(yùn)決定機(jī)制等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。體內(nèi)T細(xì)胞篩選則依托過繼轉(zhuǎn)移模型。從能同時表達(dá)Cas9和特異性T細(xì)胞受體的雙轉(zhuǎn)基因小鼠中提取T細(xì)胞，經(jīng)sgRNA文庫感染后轉(zhuǎn)移進(jìn)新小鼠，并利用對應(yīng)抗原激活免疫反應(yīng)。針對CD8+ T 細(xì)胞，建立了靶向淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）的工程化 T 細(xì)胞和 LCMV小鼠感染模型，OT-I小鼠和腫瘤細(xì)胞-卵清蛋白（ovalbumin, OVA）模型；針對CD4+ T 細(xì)胞，則建立了SMARTA 小鼠和 LCMV 模型，OT-II小鼠和OVA模型等。借此，研究揭示了轉(zhuǎn)錄因子Fli1等關(guān)鍵因子，以及調(diào)控記憶 T細(xì)胞反應(yīng)的營養(yǎng)信號通路等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤免疫中的重要作用，成為潛在的治療靶點(diǎn)。

文章進(jìn)一步歸納CRISPR篩選在腫瘤細(xì)胞中的體內(nèi)和體外應(yīng)用，凝練出相關(guān)的研究路徑。針對腫瘤細(xì)胞的體外篩選通常采用“雙細(xì)胞互作”的篩選體系，即腫瘤細(xì)胞-免疫細(xì)胞在體外共培養(yǎng)。借此，研究人員鑒定出多種調(diào)節(jié)腫瘤對免疫細(xì)胞殺傷和免疫檢查點(diǎn)治療敏感的關(guān)鍵因子及相關(guān)調(diào)控機(jī)制。體內(nèi)篩選則通常采用兩種不同的免疫壓力模型：一種是免疫缺陷模型，比較野生型小鼠和免疫缺陷小鼠腫瘤模型中的腫瘤細(xì)胞；一種是免疫治療模型，比較野生型小鼠和施加免疫檢查點(diǎn)抑制劑或腫瘤疫苗等措施的免疫增強(qiáng)小鼠腫瘤模型中的腫瘤細(xì)胞；也可以將免疫缺陷模型和免疫治療模型結(jié)合，形成四種程度的免疫壓力。借此，研究人員揭示出檢查點(diǎn)激酶2（Chek2）等因子在腫瘤與免疫細(xì)胞互作中發(fā)揮的重要作用。

盡管CRISPR篩選在腫瘤免疫研究中應(yīng)用廣泛，但仍面臨多重挑戰(zhàn)。其核心問題是如何高效地、安全地將 CRISPR 介導(dǎo)的基因編輯工具傳遞到腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞中。同時，CRISPR 技術(shù)仍面臨潛在的脫靶效應(yīng)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和安全性?；谏疃葘W(xué)習(xí)與人工智能技術(shù)的快速發(fā)展，脫靶位點(diǎn)的預(yù)測、評估與優(yōu)化平臺正不斷構(gòu)建，有望解決這一問題。目前CRISPR篩選的精度已經(jīng)提高到單堿基水平，但仍局限于特定的堿基替換。先導(dǎo)編輯器（prime editors, PEs）能夠進(jìn)行多種類型基因修改且脫靶效應(yīng)較低，未來有望應(yīng)用于CRISPR 篩選中，進(jìn)一步提高分辨率。盡管如此，CRISPR篩選鑒定出的潛在治療靶點(diǎn)只是開發(fā)有效免疫治療策略的初步階段，科研發(fā)現(xiàn)向臨床治療成果的轉(zhuǎn)化仍面臨諸多挑戰(zhàn)和較長的路徑。

浙江大學(xué)良渚實(shí)驗(yàn)室侯宇研究員、郭紅山研究員為本文的通訊作者，實(shí)驗(yàn)室本科生李敏亦為本文的第一作者。相關(guān)研究得到了浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LQN25H160049，LR24C060001）的資助。

文章信息

李敏亦，李婉玉，郭紅山，等。CRISPR篩選技術(shù)在腫瘤免疫研究中的最新進(jìn)展 . 科學(xué)通報(bào), 2025.

https://www.sciengine.com/doi/10.1360/CSB-2025-5052.

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