腫瘤異質(zhì)性是治療過程中出現(xiàn)耐藥和免疫逃逸的關(guān)鍵驅(qū)動因素。傳統(tǒng)治療在殺傷效率、系統(tǒng)毒性等之間始終難以取得平衡。近年來，以免疫檢查點抑制劑、過繼性細(xì)胞療法為代表的免疫治療策略，通過重編程宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)持久的免疫記憶效應(yīng)，成為繼手術(shù)、放化療之后，惡性腫瘤系統(tǒng)治療的新基石。

免疫治療的療效高度依賴靶點的精準(zhǔn)遴選；CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）基因組篩選技術(shù)，基于CRISPR基因編輯技術(shù)，憑借其高通量、高保真和可編程優(yōu)勢，已成為從基因庫中系統(tǒng)鑒定廣譜、高效且低毒性免疫靶點的核心手段。因此，系統(tǒng)性總結(jié)CRISPR篩選技術(shù)在腫瘤免疫研究中應(yīng)用的進(jìn)展，能夠為從事腫瘤和免疫學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)和臨床科學(xué)家提供一定的理論指導(dǎo)。

近日，浙江大學(xué)良渚實驗室侯宇、郭紅山團(tuán)隊在《科學(xué)通報》發(fā)表了題為“CRISPR篩選技術(shù)在腫瘤免疫研究中的最新進(jìn)展”的評述文章，聚焦CRISPR篩選技術(shù)在腫瘤免疫治療中的前沿應(yīng)用，系統(tǒng)闡述其對免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高通量基因功能篩選，從而精準(zhǔn)鎖定調(diào)控腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸的關(guān)鍵分子，進(jìn)一步揭示腫瘤-免疫互作新機(jī)制，為優(yōu)化免疫療法并促進(jìn)個性化精準(zhǔn)治療奠定了基礎(chǔ)。

文章完整呈現(xiàn)了CRISPR篩選從基礎(chǔ)編輯工具到多模態(tài)整合技術(shù)的迭代路徑，從簡單對基因組進(jìn)行敲除（CRISPR knockout）、敲降（CRISPRi）或過表達(dá)（CRISPRa）到實現(xiàn)對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（Perturb-seq、CRISP-seq和CROP-seq）、蛋白組（Perturb-CITE-seq）及代謝組層面同時捕獲信息，從而深入研究基因?qū)?xì)胞表型的多維影響。CRISPR 篩選技術(shù)可進(jìn)一步與原位測序和高通量成像技術(shù)（如光學(xué)混合篩選技術(shù)）以及成像空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Perturb-FISH）等相結(jié)合，實現(xiàn)對基因擾動的高分辨率時空分析。

依托CRISPR篩選技術(shù)多層次的信息讀取能力，腫瘤免疫研究進(jìn)入了新的發(fā)展階段。將CRISPR篩選技術(shù)應(yīng)用到免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，解析出驅(qū)動腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵信號節(jié)點與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)化現(xiàn)有免疫治療策略。文章系統(tǒng)總結(jié)了CRISPR篩選在免疫細(xì)胞中的應(yīng)用，進(jìn)一步涵蓋了NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等缺乏關(guān)注的免疫亞群，并歸納出利用CRISPR篩選的研究范式。

圖1 CRISPR篩選流程示意圖

針對人原代 T 細(xì)胞的體外篩選歷來難度較大；隨著 CRISPR 敲除、CRISPRa、CRISPRi、堿基編輯和RNA編輯等一系列篩選平臺相繼成熟，研究者已順利鑒定出 BATF3、鉛靶蛋白PRODH2 等調(diào)控免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，并闡明了輔助性T細(xì)胞命運決定機(jī)制等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。體內(nèi)T細(xì)胞篩選則依托過繼轉(zhuǎn)移模型。從能同時表達(dá)Cas9和特異性T細(xì)胞受體的雙轉(zhuǎn)基因小鼠中提取T細(xì)胞，經(jīng)sgRNA文庫感染后轉(zhuǎn)移進(jìn)新小鼠，并利用對應(yīng)抗原激活免疫反應(yīng)。針對CD8+ T 細(xì)胞，建立了靶向淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）的工程化 T 細(xì)胞和 LCMV小鼠感染模型，OT-I小鼠和腫瘤細(xì)胞-卵清蛋白（ovalbumin, OVA）模型；針對CD4+ T 細(xì)胞，則建立了SMARTA 小鼠和 LCMV 模型，OT-II小鼠和OVA模型等。借此，研究揭示了轉(zhuǎn)錄因子Fli1等關(guān)鍵因子，以及調(diào)控記憶 T細(xì)胞反應(yīng)的營養(yǎng)信號通路等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤免疫中的重要作用，成為潛在的治療靶點。

文章進(jìn)一步歸納CRISPR篩選在腫瘤細(xì)胞中的體內(nèi)和體外應(yīng)用，凝練出相關(guān)的研究路徑。針對腫瘤細(xì)胞的體外篩選通常采用“雙細(xì)胞互作”的篩選體系，即腫瘤細(xì)胞-免疫細(xì)胞在體外共培養(yǎng)。借此，研究人員鑒定出多種調(diào)節(jié)腫瘤對免疫細(xì)胞殺傷和免疫檢查點治療敏感的關(guān)鍵因子及相關(guān)調(diào)控機(jī)制。體內(nèi)篩選則通常采用兩種不同的免疫壓力模型：一種是免疫缺陷模型，比較野生型小鼠和免疫缺陷小鼠腫瘤模型中的腫瘤細(xì)胞；一種是免疫治療模型，比較野生型小鼠和施加免疫檢查點抑制劑或腫瘤疫苗等措施的免疫增強(qiáng)小鼠腫瘤模型中的腫瘤細(xì)胞；也可以將免疫缺陷模型和免疫治療模型結(jié)合，形成四種程度的免疫壓力。借此，研究人員揭示出檢查點激酶2（Chek2）等因子在腫瘤與免疫細(xì)胞互作中發(fā)揮的重要作用。

盡管CRISPR篩選在腫瘤免疫研究中應(yīng)用廣泛，但仍面臨多重挑戰(zhàn)。其核心問題是如何高效地、安全地將 CRISPR 介導(dǎo)的基因編輯工具傳遞到腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞中。同時，CRISPR 技術(shù)仍面臨潛在的脫靶效應(yīng)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和安全性?；谏疃葘W(xué)習(xí)與人工智能技術(shù)的快速發(fā)展，脫靶位點的預(yù)測、評估與優(yōu)化平臺正不斷構(gòu)建，有望解決這一問題。目前CRISPR篩選的精度已經(jīng)提高到單堿基水平，但仍局限于特定的堿基替換。先導(dǎo)編輯器（prime editors, PEs）能夠進(jìn)行多種類型基因修改且脫靶效應(yīng)較低，未來有望應(yīng)用于CRISPR 篩選中，進(jìn)一步提高分辨率。盡管如此，CRISPR篩選鑒定出的潛在治療靶點只是開發(fā)有效免疫治療策略的初步階段，科研發(fā)現(xiàn)向臨床治療成果的轉(zhuǎn)化仍面臨諸多挑戰(zhàn)和較長的路徑。

浙江大學(xué)良渚實驗室侯宇研究員、郭紅山研究員為本文的通訊作者，實驗室本科生李敏亦為本文的第一作者。相關(guān)研究得到了浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LQN25H160049，LR24C060001）的資助。

文章信息

李敏亦，李婉玉，郭紅山，等。CRISPR篩選技術(shù)在腫瘤免疫研究中的最新進(jìn)展 . 科學(xué)通報, 2025.

https://www.sciengine.com/doi/10.1360/CSB-2025-5052.

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