在微生物合成生物學領域，科學家致力于通過理性工程化手段重新編程微生物細胞，賦予其全新的功能以滿足多樣化需求。然而，這種干預往往擾動宿主原有的代謝網(wǎng)絡，帶來系統(tǒng)復雜性與不可預測性上升的問題。為應對這一挑戰(zhàn)，研究人員逐步發(fā)展出一系列“正交”策略，即在微生物內(nèi)部構(gòu)建與天然系統(tǒng)相對隔離的遺傳、代謝、能量與調(diào)控系統(tǒng)。這些系統(tǒng)能夠獨立于宿主運行，在減少干擾的同時實現(xiàn)更精確的功能控制，為高效、可編程的細胞工廠構(gòu)建開辟了新路徑。

近日，江南大學吳靜教授團隊在Cell Press旗下期刊《Trends in Biotechnology》發(fā)表了題為《Recruiting orthogonal biological systems for engineering microorganisms》的綜述文章。該文系統(tǒng)回顧了正交生物學系統(tǒng)在微生物工程中的最新進展，涵蓋遺傳信息、代謝途徑、能量供應與調(diào)控網(wǎng)絡四個關(guān)鍵層面，并展望了未來如何通過集成化設計推動微生物合成生物學邁向更高效、更可控的新階段。

在正交遺傳系統(tǒng)方面，研究重點圍繞DNA復制、轉(zhuǎn)錄與翻譯三個層面構(gòu)建獨立于宿主的遺傳信息處理平臺。酵母中的OrthoRep系統(tǒng)利用兩個獨立復制的質(zhì)粒實現(xiàn)了目標基因的高突變率連續(xù)進化，已成功應用于TrpB等酶的快速演化。類似地，近年來在大腸桿菌中開發(fā)的BacORep、EcORep等系統(tǒng)將這種能力引入細菌體系，大幅縮短了進化周期。轉(zhuǎn)錄層面的正交系統(tǒng)則以T7 RNA聚合酶為代表，通過改造啟動子識別特性，實現(xiàn)與宿主轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的隔離。在翻譯層面，研究人員通過構(gòu)建正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA對以及正交核糖體/mRNA對，實現(xiàn)了非天然氨基酸的定點引入，為新型蛋白質(zhì)合成提供了可能。

正交代謝途徑的構(gòu)建則致力于將目標產(chǎn)物的合成與中心碳代謝解耦，減少與宿主代謝的干擾。代表性策略包括非氧化 glycolysis（NOG）途徑，該途徑可在不釋放二氧化碳的前提下將果糖-6-磷酸高效轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，提升碳原子利用率。此外，利用非常規(guī)底物如木糖、半乳糖醛酸構(gòu)建的非磷酸化途徑，以及基于異構(gòu)體前體NPP構(gòu)建的單萜合成模塊，均在酵母和大腸桿菌中實現(xiàn)了高效產(chǎn)物積累。在空間層面上，研究還利用天然細胞器如過氧化物酶體，以及人工構(gòu)建的無膜細胞器（MLO）對多酶途徑進行區(qū)室化隔離，有效提高了合成效率并減少中間產(chǎn)物毒性。

在正交能量系統(tǒng)方面，研究者致力于開發(fā)與天然輔因子隔離的能量載體。通過改造NAD+結(jié)構(gòu)中的AMP部分，獲得了一系列半合成或全合成的正交氧化還原輔因子，如NMN+、NCD+等。其中NCD+可在工程菌中積累至5 mM以上，遠超天然輔因子濃度。為提升這些輔因子的實用性，研究進一步通過理性設計或生長耦聯(lián)的高通量篩選策略改造代謝酶，使其能夠高效識別并利用這些非天然輔因子。例如，通過多輪飽和突變篩選獲得的甲酸脫氫酶突變體，其對NCD+的選擇性提高了3700倍，并在連續(xù)運行16天的反應中保持高效輔因子循環(huán)。

正交調(diào)控系統(tǒng)則支撐了更復雜的基因表達與細胞間通信。在胞內(nèi)層面，基于CRISPR的轉(zhuǎn)錄激活與干擾系統(tǒng)可同時、正交調(diào)控多個基因，推動復雜代謝通路的優(yōu)化。同時，人工sigma因子和人工轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合相應啟動子，建立了獨立于宿主的調(diào)控線路。在細胞間層面，研究人員利用不同結(jié)構(gòu)的酰基高絲氨酸內(nèi)酯構(gòu)建了正交的種內(nèi)與種間通信系統(tǒng)。通過設計包含不同信號分子的“捕食者-獵物”菌群系統(tǒng)，實現(xiàn)了種群密度和代謝行為的動態(tài)調(diào)控，為構(gòu)建智能微生物群落奠定了基礎。

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