細(xì)胞死亡是生命體維持穩(wěn)態(tài)的重要過程。細(xì)胞凋亡（apoptosis）和壞死（necrosis）是兩種形態(tài)和機(jī)制截然不同的死亡方式。凋亡由caspase蛋白酶介導(dǎo)，過程中細(xì)胞膜保持完整，細(xì)胞內(nèi)容物被有序包裹在凋亡小體中，通過“胞葬作用”被清除，不會引發(fā)炎癥反應(yīng)。而壞死則以早期細(xì)胞膜完整性喪失為特征，內(nèi)容物泄漏，往往誘發(fā)炎癥和自身免疫病理。然而，與凋亡中caspase介導(dǎo)的廣泛蛋白切割已被清晰認(rèn)知不同，壞死終末階段是否發(fā)生類似的系統(tǒng)性蛋白水解事件，長期以來我們知之甚少。

2026年4月7日，中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心袁鈞瑛院士和單冰研究員團(tuán)隊(duì)在《Vita》期刊發(fā)表了題為“Distinct necrotic protein cleavages define terminal events in necrosis”的研究論文。該研究系統(tǒng)揭示了壞死細(xì)胞在質(zhì)膜破裂后，胞外胰蛋白酶樣蛋白酶侵入細(xì)胞內(nèi)，對大量蛋白底物進(jìn)行特異性切割，這一過程驅(qū)動(dòng)核結(jié)構(gòu)重塑、染色質(zhì)DNA降解，并促進(jìn)壞死細(xì)胞殘骸的吞噬清除，從而限制自身免疫病理。

研究團(tuán)隊(duì)首先利用三維光學(xué)衍射斷層掃描技術(shù)對活細(xì)胞進(jìn)行無標(biāo)記成像，發(fā)現(xiàn)壞死細(xì)胞（包括壞死性凋亡和鐵死亡）的核膜和核仁在早期即變得彌散，折射率顯著下降；而凋亡細(xì)胞則形成典型的凋亡小體，核膜相對完整。免疫熒光染色進(jìn)一步顯示，壞死細(xì)胞中核纖層蛋白Lamin-B1信號特異性喪失，但核孔復(fù)合物蛋白Nup98信號仍保留；凋亡細(xì)胞則表現(xiàn)為核膜變形但兩者信號均存在。值得注意的是，在誘導(dǎo)焦亡的LPS/Nigericin處理中，單個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)出兩種不同的死亡形態(tài)：部分細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡樣，部分表現(xiàn)為壞死樣，揭示了焦亡執(zhí)行方式的異質(zhì)性。

通過蛋白質(zhì)免疫印跡分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)壞死細(xì)胞中Lamin-B1和Lamin-A/C產(chǎn)生與凋亡截然不同的切割產(chǎn)物：壞死產(chǎn)生約50 kDa和55 kDa的較大片段，而凋亡產(chǎn)生約40 kDa和30 kDa的較小片段。這些壞死特異性切割可被RIPK1、RIPK3、MLKL抑制劑或鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1所阻斷，并在小鼠腎缺血再灌注損傷模型中同樣被觀察到，提示該現(xiàn)象具有體內(nèi)病理生理相關(guān)性。

利用SYTOX Green標(biāo)記喪失質(zhì)膜完整性的細(xì)胞并進(jìn)行流式分選，研究者發(fā)現(xiàn)壞死性Lamin-B1切割僅發(fā)生在SYTOX Green陽性細(xì)胞中，而磷酸化MLKL在陰性和陽性細(xì)胞中均可檢測到。這一關(guān)鍵結(jié)果表明：壞死性蛋白切割發(fā)生在質(zhì)膜破裂之后，是細(xì)胞死亡執(zhí)行終末階段的事件。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這一切割可被廣譜蛋白酶抑制劑leupeptin有效抑制，且依賴于培養(yǎng)基中胎牛血清或新鮮小鼠血清中的蛋白酶，提示胞外蛋白酶在質(zhì)膜破裂后侵入細(xì)胞介導(dǎo)了這些切割事件。

為了系統(tǒng)鑒定壞死中的蛋白切割底物，團(tuán)隊(duì)開展了neo-N端組學(xué)分析。在壞死性凋亡的HT29細(xì)胞、BMDMs以及小鼠腎缺血再灌注損傷模型中，他們鑒定出大量以精氨酸/賴氨酸殘基后切割為特征的neo-N端肽段。其中在BMDMs和AKI模型中共有的切割肽段達(dá)1253條，源自772個(gè)蛋白，切割位點(diǎn)同樣高度富集于精氨酸/賴氨酸之后。這些特征與胰蛋白酶樣蛋白酶的切割特異性高度一致，且可被leupeptin抑制。通過質(zhì)譜鑒定和功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，PRSS家族胰蛋白酶和纖溶酶原被證實(shí)可介導(dǎo)這些壞死性蛋白切割。

研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，leupeptin抑制這些切割事件后，可顯著減輕壞死細(xì)胞中基因組DNA的降解，保護(hù)核膜和核仁結(jié)構(gòu)的完整性。在吞噬實(shí)驗(yàn)中，抑制壞死性切割會減少巨噬細(xì)胞對壞死細(xì)胞核組分的吞噬，但對胞質(zhì)成分的攝取無影響。將經(jīng)leupeptin處理的壞死細(xì)胞注射到小鼠腹腔后，可導(dǎo)致脾腫大和血清自身抗體水平升高，表明壞死性蛋白切割在促進(jìn)壞死細(xì)胞清除、防止自身免疫中發(fā)揮重要作用。

最后，研究團(tuán)隊(duì)針對ABHD16A（切割于R178之后）和GLUD1（切割于K397之后）開發(fā)了特異性識別壞死切割產(chǎn)物的單克隆抗體。這些抗體能夠在小鼠腎缺血再灌注損傷、肝缺血再灌注損傷、腸道炎癥模型以及人糖尿病腎病樣本中特異性地標(biāo)記壞死細(xì)胞，為在組織和疾病背景下評估壞死終末事件提供了重要的研究工具。

論文的通訊作者是中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心主任袁鈞瑛院士和單冰副研究員。第一作者是中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心李甘泉博士。中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心張耀陽研究員給N端標(biāo)記蛋白質(zhì)譜分析提供寶貴建議，北京大學(xué)陳良怡研究員對超分辨率ODT顯微成像技術(shù)的使用提供了寶貴幫助，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院李佩盈研究員提供了寶貴的病人樣本。

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