提起CRISPR-Cas9， 很多人的第一反應(yīng)都是 “基因 魔剪 ” —— 識(shí)別 靶標(biāo) 、精準(zhǔn)切割，改寫基因組。但在細(xì)菌的CRISPR免疫系統(tǒng)里，決定“能不能精準(zhǔn)出刀”的，往往不是切割，而是更早一步的適應(yīng)階段 （adaptation）—— 把外源DNA的一小段片段篩選、加工并整合進(jìn)CRISPR陣列，形成可遺傳的“免疫記憶”。

CRISPR-Cas系統(tǒng)通過將外源DNA片段寫入宿主CRISPR陣列，建立可遺傳的“免疫記憶”。在這一 過程中 ，系統(tǒng)不僅要從海量外源DNA中優(yōu)先鎖定帶PAM線索的候選片段，還要將其加工成合規(guī)的spacer長(zhǎng)度并保證方向性整合，才能為后續(xù)干擾階段的精準(zhǔn)識(shí)別打下基礎(chǔ)。然而，在典型II-A型CRISPR系統(tǒng)中Cas1本身并不具備PAM識(shí)別能力，這使得“PAM如何被識(shí)別并與prespacer選擇耦聯(lián)”長(zhǎng)期缺乏直接證據(jù)。

2026年2月16日 ，中國(guó)藥科大學(xué)肖易倍團(tuán)隊(duì) 和新加坡國(guó)大 學(xué)駱敏團(tuán)隊(duì) 的合作 在MolecularCell發(fā)表題為Structural basis for Cas9-directed spacer acquisition in type II-A CRISPR-Cas systems的研究論文 ，通過解析II-A CRISPR系統(tǒng)中關(guān)鍵適應(yīng)復(fù)合體的多種冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，闡明該系統(tǒng)中所有四個(gè)蛋白，Cas9與Csn2、Cas1-Cas2組裝成超級(jí)復(fù)合體共同完成這一系列流程的分子機(jī)制。研 究發(fā)現(xiàn)：Cas9在適應(yīng)階段并非單純“出手切割”，而是承擔(dān)前端“偵察 —— 篩查”的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)功能，與Csn2共同完成PAM掃描與prespacer定標(biāo)，并通過“退出”觸發(fā)整合模塊重排，最終將合格片段交由Cas1–Cas2寫入CRISPR陣列。

研究團(tuán)隊(duì)首先在體外穩(wěn)定重構(gòu)了Cas9、Csn2與Cas1–Cas2的四蛋白復(fù)合體，并捕捉到其apo狀態(tài)的“休眠/待命”構(gòu)象。該超級(jí)復(fù)合體中Cas9的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域（尤其與活化相關(guān)的REC3區(qū)域）被Csn2與Cas1–Cas2界面約束在更為閉合的待機(jī)構(gòu)象中，與實(shí)驗(yàn)觀察到的Cas9 在 Csn2與Cas1–Cas2 存在的條件下 切割活性顯著降低相一致，提示該裝配形態(tài)更偏向于DNA偵察與候選片段篩查，從而避免適應(yīng)階段的非特異損傷。

為追蹤PAM選擇過程，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了不與crRNA互補(bǔ)但含單一PAM的dsDNA底物。在DNA加入后，原先體積龐大的超級(jí)復(fù)合體發(fā)生顯著重排，形成更緊湊的 前間隔序列（ prespacer ）捕獲復(fù)合物 。在該狀態(tài)下，Cas9與DNA形成可滑動(dòng)、可檢驗(yàn) 序列 的結(jié)合方式，提示Cas9可沿DNA進(jìn)行 P AM掃描驗(yàn)證，并以PAM為關(guān)鍵判據(jù)鎖定合格候選片段。

更為關(guān)鍵的是，結(jié)構(gòu)顯示dsDNA末端被導(dǎo)入Csn2的中心通道，并與復(fù)合體構(gòu)型共同形成一種“導(dǎo)流槽 + 尺子”式的幾何約束。在這一約束下，候選DNA片段被定標(biāo)為約30 bp的標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度，恰好匹配可被Cas1–Cas2整合的 前間隔序列的長(zhǎng) 度。由此，Cas9負(fù)責(zé)PAM線索的掃描與驗(yàn)收，Csn2負(fù)責(zé)末端捕獲與長(zhǎng)度定標(biāo)，兩者協(xié)同將“可用材料”精準(zhǔn)交付給 C as1-Cas2整合模塊。

研究還捕捉到缺失Cas9的相關(guān)結(jié)構(gòu)狀態(tài)。值得注意的是，Cas9的“退場(chǎng)讓路”并非簡(jiǎn)單解離，而是伴隨Csn2–Cas1–Cas2裝配體發(fā)生重排：原先受約束的PAM近端DNA被暴露出來，使Cas1–Cas2能夠更順暢地裝載并進(jìn)入后續(xù)的 前間隔序列 加工與方向性整合步驟。這一結(jié)構(gòu)開關(guān)機(jī)制為理解II-A型系統(tǒng)如何完成PAM依賴選擇與整合前準(zhǔn)備，提供了關(guān)鍵線索。

綜上，該研究在結(jié)構(gòu)層面串聯(lián)了II-A型CRISPR適應(yīng)階段的關(guān)鍵事件：休眠態(tài)復(fù)合體先將Cas9限制在低切割的待機(jī)姿態(tài)；游離的DNA末端被Csn2捕獲后傳導(dǎo)至Cas9，隨后Cas9沿DNA滑動(dòng)掃描并識(shí)別PAM序列；Csn2和Cas9共同將候選片段定標(biāo)至約30 bp；隨后Cas9解離觸發(fā)裝配體重排，暴露PAM近端DNA并促使Cas1–Cas2接管完成整合。這不僅重新定義了Cas9在細(xì)菌免疫中的角色，也為理解CRISPR記憶生成的“質(zhì)量控制”提供了新的結(jié)構(gòu)框架。

中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院 肖易倍 教授、生命科學(xué)院 陸美玲 副教授和新加坡國(guó)立大學(xué)駱敏教授為共同通訊作者，中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院 李兆星 研究員 、 博士研究生 李 鈺 濤為共同第一作者。 此外。中國(guó)藥科大學(xué)陳美容教授；研究生孔健平、吳宛倩、黃平平、曾婷、武倩倩、張煜；本科生劉勇峰、林瀚豐、侯力裘、劉宮羽，新加坡國(guó)立大學(xué)胡純一教授、何雨瞳博士，以及艾迪貝克楊振煌博士對(duì)本課題的完成均付出了重要的貢獻(xiàn)。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.01.024

制版人： 十一

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