2026年1月2日，上海交通大學(xué)宋萍團(tuán)隊(duì)聯(lián)合國(guó)際和平婦幼保健院王玉東教授在在NatureBiomedicalEngineering期刊上發(fā)表題為“Anchored random reverse primer sequencingfor quantitative detection of novel gene fusions”的最新研究。該研究提出了一種全新的隨機(jī)引物錨定測(cè)序技術(shù)（ARRP-seq）,不僅可實(shí)現(xiàn)痕量低頻率融合基因的高效檢測(cè)，還能在一次檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)對(duì)點(diǎn)突變、可變剪接、片段缺失插入等多種核酸變異的同時(shí)分析。研究已在宮頸癌、前列腺癌等多種癌癥的診斷中取得顯著應(yīng)用效果,有望應(yīng)用于感染性疾病、衰老相關(guān)退行性疾病、器官移植排斥等疾病的分析。

基因組不穩(wěn)定性伴隨生命全過(guò)程，持續(xù)產(chǎn)生的點(diǎn)突變、缺失、插入及染色體重排等變異中，融合基因因其可瞬時(shí)激活原癌基因或抑制抑癌基因，成為驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子事件之一。然而，現(xiàn)有研究及檢測(cè)體系仍以單堿基突變和小片段Indel為主，對(duì)融合基因的全面篩查與功能解析相對(duì)不足，漏檢風(fēng)險(xiǎn)日益凸顯。

FISH、常規(guī)RNA-seq與PCR等現(xiàn)有融合基因檢測(cè)方法分別受限于探針覆蓋位點(diǎn)單一、低頻融合覆蓋度低及引物預(yù)設(shè)固定斷點(diǎn)等問(wèn)題，難以系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)未知融合且靈敏度不足。為此，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了隨機(jī)引物多重錨定測(cè)序技術(shù)（ARRP-seq），在單管反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)針對(duì)痕量核酸低頻融合、點(diǎn)突變等多核酸變異的高效捕獲且高靈敏低成本分析，突破傳統(tǒng)方法對(duì)未知融合斷點(diǎn)的識(shí)別壁壘。

通過(guò)高頻變異靶向引物與隨機(jī)引物協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)高通量、高均一性富集，將捕獲效率由傳統(tǒng)連接法的12%提升至89%。在性能測(cè)試中，該技術(shù)表現(xiàn)出更高的可重復(fù)性，且在檢測(cè)區(qū)間5 ng至100 ng RNA范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，較傳統(tǒng)方法降低20倍的樣本需要量,表現(xiàn)出在痕量臨床樣本分析中的應(yīng)用潛力。此外，研究團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建針對(duì)未知融合基因鑒定的生物信息學(xué)方法，顯著提高了分析的精準(zhǔn)度，引入多重閾值過(guò)濾，結(jié)合對(duì)齊-驗(yàn)證-投票三級(jí)策略,有效提高了融合基因檢測(cè)的真陽(yáng)性率，將特異性提高至100%，且始終保持100%的靈敏度。

ARRP-seq用于未知融合基因檢測(cè)的原理圖：相比常規(guī)方法，對(duì)低頻未知融合基因的捕獲效率顯著提高，為新標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供高效工具。

ARRP-seq生信分析優(yōu)化流程：通過(guò)在靶向建庫(kù)數(shù)據(jù)分析中引入一系列特異性過(guò)濾器，對(duì)初步結(jié)果進(jìn)行二次校驗(yàn)與比對(duì)，提升了分析流程的特異性。

為了進(jìn)一步提升融合基因的檢測(cè)靈敏度，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合了先前開(kāi)發(fā)的多重核酸抑制探針技術(shù)（mBDA，Nat.Biomed.Eng 2021,5,690），將ARRP-seq的檢測(cè)限降至0.1%的融合基因頻率（BAF），并在理論上實(shí)現(xiàn)了0.01% BAF的檢測(cè)能力，靈敏度較其他靶向檢測(cè)方法提高約10倍，較RNA-seq方法提高50倍，這一突破使得融合基因檢測(cè)的靈敏度大幅提升。在臨床應(yīng)用中，通常檢測(cè)的變異頻率常低于0.1%，甚至低于0.01%，ARRP-seq檢測(cè)限的降低更有利于檢測(cè)實(shí)際臨床樣品中低頻率的融合基因，并且為發(fā)現(xiàn)新的核酸變異標(biāo)志物、早期診斷及精準(zhǔn)治療等提供了更大的潛力。

在宮頸癌研究中，研究團(tuán)隊(duì)將ARRP-seq應(yīng)用在多類(lèi)樣品中，包括8例癌旁組織及33例腫瘤組織，檢測(cè)到42個(gè)新型融合基因標(biāo)志物，并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示一致率為100%。此外，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染融合基因的癌細(xì)胞系增殖水平顯著增加，進(jìn)一步證明了融合基因在宮頸癌中的潛在致癌作用。ARRP-seq在宮頸癌的成功應(yīng)用，提示其為靶向藥物開(kāi)發(fā)、臨床指導(dǎo)治療提供了有效工具。

此外，研究團(tuán)隊(duì)將該技術(shù)應(yīng)用于前列腺癌精準(zhǔn)診斷。通過(guò)綜合分析點(diǎn)突變和可變剪接等信息，建立了高效分類(lèi)模型。該模型在前列腺癌樣本中的分類(lèi)AUC值達(dá)到了0.88，高于傳統(tǒng)前列腺特異性抗原檢測(cè)的AUC值（0.63）。這一結(jié)果展示了ARRP-seq在癌癥相關(guān)早期診斷和精準(zhǔn)治療中的潛力。

研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了針對(duì)痕量低頻多種核酸變異分析的測(cè)序技術(shù)ARRP-seq，將包括未知融合在內(nèi)的多核酸變異的捕獲效率從12%提高至89%，結(jié)合mBDA技術(shù)后更將理論檢測(cè)限大幅降低至0.01%，刷新了行業(yè)檢測(cè)極限。針對(duì)不同加入量核酸樣本實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定分析，較傳統(tǒng)RNA-seq方法而言，在提高靈敏度的同時(shí)大幅降低測(cè)序成本，有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。放眼未來(lái)，該技術(shù)不僅可以應(yīng)用于腫瘤診斷、分子分型及用藥指導(dǎo)，還有望應(yīng)用于感染性疾病、衰老相關(guān)退行性疾病、器官移植排斥等疾病的分析。

上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生修學(xué)浩、吳熠與博士后李江雪為該論文的共同第一作者。上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院宋萍副教授與上海交通大學(xué)附屬?lài)?guó)際和平婦幼保健院院長(zhǎng)王玉東為共同通訊作者。

文章鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41551-025-01564-9

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