摘要：生物制藥生產(chǎn)中，澄清工藝作為上游收獲環(huán)節(jié)的關(guān)鍵步驟，負(fù)責(zé)去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的不溶性固體、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，為下游純化奠定基礎(chǔ)。傳統(tǒng)上該工藝被認(rèn)為對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）貢獻(xiàn)有限，但隨著細(xì)胞密度和產(chǎn)物滴度提升，其重要性日益凸顯。本文圍繞質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念，系統(tǒng)闡述澄清工藝的優(yōu)化策略，包括 QbD 核心概念應(yīng)用、澄清技術(shù)選擇、關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）與關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）界定、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）的實(shí)踐應(yīng)用等，為生物制藥澄清工藝的高效開(kāi)發(fā)與質(zhì)量控制提供參考。

一、QbD 理念在生物制藥中的發(fā)展與應(yīng)用

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念始于 20 世紀(jì) 70 年代，由約瑟夫?朱蘭博士提出，核心是將質(zhì)量設(shè)計(jì)融入產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)全過(guò)程，而非依賴最終產(chǎn)品檢驗(yàn)。ICH Q8 (R2) 將其定義為 “基于科學(xué)和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理，強(qiáng)調(diào)對(duì)產(chǎn)品和工藝的理解及控制的系統(tǒng)開(kāi)發(fā)方法”。

2003 年美國(guó) FDA 推行當(dāng)前良好生產(chǎn)規(guī)范（cGMP），2005 年 EMA 和 ICH 相繼出臺(tái)相關(guān)指南，推動(dòng) QbD 在制藥行業(yè)的應(yīng)用。起初 QbD 多用于小分子藥物生產(chǎn)，2009 年后逐漸拓展至生物制藥領(lǐng)域，尤其在單克隆抗體（mAb）產(chǎn)品中應(yīng)用廣泛。

如圖 1 所示，單克隆抗體在生物制藥市場(chǎng)中占比達(dá) 25%，2009-2021 年獲批數(shù)量從約 10 個(gè)增至 50 個(gè)。2022 年 WHO 發(fā)布針對(duì) mAb 產(chǎn)品的 QbD 指南，進(jìn)一步推動(dòng)其在生物制藥中的規(guī)范化應(yīng)用，為患者安全和生產(chǎn)效率提升提供保障。

圖1：生物制藥市場(chǎng)產(chǎn)品類型占比

二、生物制藥澄清工藝概述與技術(shù)選擇

澄清工藝是生物制藥上游生產(chǎn)的核心環(huán)節(jié)，通過(guò)離心、過(guò)濾、沉淀或絮凝等技術(shù)，去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的不溶性固體、細(xì)胞、碎片等雜質(zhì)，保留目標(biāo)產(chǎn)物并部分去除宿主細(xì)胞蛋白（HCP）等可溶性雜質(zhì)，為下游純化減負(fù)。

近年來(lái)，一次性深層過(guò)濾技術(shù)因成本效益高、操作高效等優(yōu)勢(shì)備受青睞。隨著細(xì)胞密度提升，沉淀和絮凝預(yù)處理技術(shù)逐漸興起，通過(guò)調(diào)節(jié) pH、添加絮凝劑等使雜質(zhì)聚集，再結(jié)合深層過(guò)濾實(shí)現(xiàn)高效分離。

表 1 對(duì)比了常用沉淀劑和絮凝劑的作用機(jī)制、操作條件及效果。例如，低 pH - 金屬沉淀通過(guò)電荷中和作用，HCP 去除率可達(dá) 1-3 LRV；陽(yáng)離子絮凝劑借助靜電氫鍵作用，DNA 去除率高達(dá) 4-6 LRV，但需關(guān)注 scalability 和毒性問(wèn)題。選擇預(yù)處理技術(shù)時(shí)，需綜合考慮雜質(zhì)去除效果、產(chǎn)物穩(wěn)定性和成本等因素。

表 1：預(yù)處理過(guò)程中常用沉淀劑和絮凝劑的對(duì)比

如圖 2 所示，澄清工藝可組合使用離心、深層過(guò)濾、微濾等技術(shù)，初級(jí)澄清去除大顆粒雜質(zhì)，次級(jí)澄清去除膠體和可溶性雜質(zhì)，部分場(chǎng)景需增加微孔過(guò)濾降低下游工藝負(fù)擔(dān)。

圖 2：生物制藥上游生產(chǎn)中初級(jí)和次級(jí)澄清步驟選項(xiàng)

三、澄清工藝的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)與關(guān)鍵參數(shù)界定

澄清工藝是上游生產(chǎn)中變異性較大的單元操作，其質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)主要來(lái)自可提取物和浸出物（E&Ls）、亞硝胺雜質(zhì)等。如圖 3 所示，BPOG 提出的浸出物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型（表 2），從生產(chǎn)流程距離（DAS）、暴露溫度、時(shí)間等維度評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，澄清工藝因使用深層過(guò)濾，風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)可能從低升至中等。

表 2：BPOG 浸出物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型示例

關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）是確保產(chǎn)品安全有效的核心指標(biāo)，澄清工藝的 CQA 包括產(chǎn)物收率、HCP、宿主細(xì)胞 DNA（HCD）、內(nèi)毒素、濁度等。關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）則包括離心速度、過(guò)濾通量（LMH）、緩沖液 pH、滲透壓、進(jìn)料壓力等，這些參數(shù)直接影響雜質(zhì)去除效果和產(chǎn)物穩(wěn)定性。

圖 4 的魚(yú)骨圖清晰展示了影響澄清工藝的關(guān)鍵因素，包括細(xì)胞系、培養(yǎng)條件、收獲規(guī)模、雜質(zhì)類型、過(guò)濾材料和工藝參數(shù)等。通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具如失效模式與影響分析（FMEA），可量化風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先級(jí)（RPN），如表 4 所示，低收率（RPN=40）、HCP 水平（RPN=36）等是需重點(diǎn)關(guān)注的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)。

圖 4：澄清工藝魚(yú)骨圖分析示例

表 4：澄清工藝相關(guān) CQA 的 FMEA 結(jié)果示例

四、QbD 在澄清工藝中的實(shí)踐路徑：從 DoE 到設(shè)計(jì)空間

QbD 在澄清工藝中的應(yīng)用遵循 “QTPP-CQA-CPP-DoE - 設(shè)計(jì)空間” 的路徑。首先明確質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況（QTPP），界定 CQA；通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估識(shí)別 CPP；借助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）優(yōu)化參數(shù)，建立設(shè)計(jì)空間，確保工藝在可接受范圍內(nèi)穩(wěn)定運(yùn)行。

早期工藝開(kāi)發(fā)階段，需優(yōu)化收獲條件（如細(xì)胞密度、存活率、pH）和篩選過(guò)濾材料。如表 7 所示，通過(guò)篩選不同初級(jí)和次級(jí)深層過(guò)濾組合，評(píng)估產(chǎn)物收率、HCP 去除率等指標(biāo)，確定最優(yōu)過(guò)濾方案。 Bracewell的研究表明，收獲時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致 HCP 水平顯著升高，需通過(guò) DoE 平衡產(chǎn)物收率和純度。

表 7：過(guò)濾材料篩選研究示例

工藝表征階段，采用響應(yīng)面法（RSM）等 DoE 技術(shù)優(yōu)化 CPP。表 8 和表 9 以通量和滲透壓為關(guān)鍵參數(shù)，設(shè)置不同水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)方差分析（ANOVA）和預(yù)測(cè)分析確定設(shè)計(jì)空間。如圖 6 和圖 7 所示，利用 JMP 軟件的預(yù)測(cè)分析器和設(shè)計(jì)空間分析器，可直觀呈現(xiàn)參數(shù)范圍對(duì) CQA 的影響，例如產(chǎn)物收率≥50% 時(shí)對(duì)應(yīng)的通量和滲透壓范圍。

表 8：澄清工藝設(shè)計(jì)空間 DoE 準(zhǔn)備

圖 6：澄清工藝預(yù)測(cè)分析器示例

圖 7：澄清工藝設(shè)計(jì)空間分析器示例

五、澄清工藝的放大與技術(shù)轉(zhuǎn)移

工藝放大是從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需確保不同規(guī)模下 CQA 的一致性。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模（1-10 L）采用小型過(guò)濾裝置（20-25 cm2），中試規(guī)模（10-100 L）選用 0.11-0.55 m2 過(guò)濾面積，生產(chǎn)規(guī)模（1000 L 以上）則需組合多個(gè)過(guò)濾裝置，過(guò)濾面積達(dá) 10-30 m2。

表 11 展示了不同細(xì)胞密度和存活率下的深層過(guò)濾選型方案，例如低細(xì)胞密度（≤10? cells/mL）高存活率時(shí)，D0SP/X0SP 組合的過(guò)濾容量可達(dá) 120-250 L/m2。放大過(guò)程中需進(jìn)行間隙分析，采用 FMEA 等工具重新評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，確保工藝穩(wěn)定性和合規(guī)性。

表 11：深層過(guò)濾材料選型示例

技術(shù)轉(zhuǎn)移階段，需整理工藝開(kāi)發(fā)報(bào)告、設(shè)計(jì)空間數(shù)據(jù)等文檔，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（3-5 批）確認(rèn)工藝在生產(chǎn)規(guī)模的可行性。同時(shí)，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，制定針對(duì)性的控制策略，確保澄清工藝滿足法規(guī)要求，為下游純化和最終產(chǎn)品質(zhì)量提供保障。

六、結(jié)語(yǔ)

傳統(tǒng)上被忽視的澄清工藝，隨著生物制藥細(xì)胞密度和產(chǎn)物滴度的提升，已成為影響產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。QbD 理念通過(guò)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和設(shè)計(jì)空間建立，為澄清工藝的優(yōu)化提供了科學(xué)方法，既能提升雜質(zhì)去除效率和產(chǎn)物收率，又能增強(qiáng)工藝穩(wěn)定性和合規(guī)性。

未來(lái)，隨著一次性技術(shù)、高通量篩選等技術(shù)的發(fā)展，QbD 在澄清工藝中的應(yīng)用將更加深入。生物制藥企業(yè)需結(jié)合產(chǎn)品特性，靈活運(yùn)用 QbD 工具，優(yōu)化工藝參數(shù)，降低質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，推動(dòng)生物制藥行業(yè)向更高效、更安全的方向發(fā)展。

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