魚糜制品具有營養(yǎng)豐富、口感細(xì)膩等特點(diǎn)，深受全球消費(fèi)者的喜愛。不同于傳統(tǒng)漂洗魚糜，不漂洗魚糜中含有較多的水溶性蛋白質(zhì)（酶）、不飽和脂質(zhì)以及金屬離子、色素等促氧化劑，在凍藏過程中易發(fā)生蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化及蛋白質(zhì)冷凍變性等變化。為確保不漂洗魚糜的質(zhì)量和穩(wěn)定性，添加抗凍劑和抗氧化劑是一種行之有效的方法。

魚糜加工中常用的抗凍劑主要為糖類、磷酸鹽類及其復(fù)配物等傳統(tǒng)抗凍劑。近年來，越來越多研究開始利用低值魚類或魚類加工副產(chǎn)物酶解制備、篩選抗凍或/和抗氧化活性成分，并在改善冷凍魚糜品質(zhì)方面顯示出較好的效果。鰱魚為我國典型的高產(chǎn)、低值淡水魚，目前主要用于加工成冷凍魚糜，而加工過程中會產(chǎn)生占魚總質(zhì)量60%～70%的副產(chǎn)物，若能利用這些副產(chǎn)物為原料制備多功能肽，重新用于魚糜產(chǎn)品的品質(zhì)提升，不僅能拓展鰱魚加工副產(chǎn)物的高值化利用途徑，還有望解決制約不漂洗魚糜工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸問題。

長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院的江祥瑤、戴新佳、王發(fā)祥*等利用鰱魚加工副產(chǎn)物制備抗凍、抗氧化雙效肽（下稱雙效肽），并評估其對不漂洗鰱魚魚糜反復(fù)凍融過程中品質(zhì)變化的影響，旨在為應(yīng)對不漂洗魚糜貯藏穩(wěn)定性差的難題提供一種新的生物源性解決方案。

1 雙效肽的制備和性質(zhì)表征

如圖1a所示，雙效肽凍干粉的水分相對含量為8.52%，蛋白質(zhì)相對含量為74.59%，灰分相對含量為13.51%，說明本研究制備的雙效肽中，除多肽（或蛋白）以外，還含有較多的灰分，其主要來源可能是酶解過程中加入的NaCl以及原料自身的少量無機(jī)鹽；Tricine-SDS-PAGE分析表明，除了12 kDa左右的條帶外，雙效肽中組分的分子質(zhì)量基本小于1.2 kDa（圖1b）。一般來說，分子質(zhì)量小于3 000 Da有利于多肽發(fā)揮生物活性。如Wang Shaoyun等的研究表明分子質(zhì)量在600～2 700 Da的抗凍肽更容易吸附至冰晶表面，從而抑制冰晶長大；鄧梅等指出淡水魚抗氧化肽的自由基清除能力與分子質(zhì)量有較強(qiáng)的相關(guān)性，分子質(zhì)量越小，清除能力越強(qiáng)；洪燕婷等的研究也表明分子質(zhì)量500～1 800 Da的多肽抗氧化活性較佳。在本研究中，制備的雙效肽經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析共鑒定出705 條肽，其中約91%的肽分子質(zhì)量小于3 000 Da，有373 條肽為預(yù)測的抗凍抗氧化雙效肽，比較典型的雙效肽序列有AVPGPMGPMGPR、DIDHDEYRF等（結(jié)果未列出）。

以熱滯活性和凍融酵母菌存活率衡量雙效肽的抗凍活性，結(jié)果如圖1c所示。雙效肽的熱滯活性為0.84 ℃，而同質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白熱滯活性僅為0.09 ℃。研究表明，當(dāng)多肽的熱滯活性處于0.6～6.0 ℃時，可被認(rèn)為是“高活性”抗凍肽。因此，本研究制備的雙效肽理論上具有較好的抗凍活性。將雙效肽加入酵母菌懸液中，凍融后酵母存活率仍為74.4%，而對照組僅為5.1%，表明雙效肽對酵母細(xì)胞具有良好抗凍保護(hù)活性，能顯著提高酵母菌凍融存活率。這與其較好的熱滯活性相印證，也與課題組前期研究鰱魚酶解產(chǎn)物對酵母菌的抗凍保護(hù)效果結(jié)果基本一致。進(jìn)一步分析雙效肽的抗氧化性質(zhì)，結(jié)果如圖1d所示。雙效肽的DPPH自由基清除率可達(dá)69.0%，ABTS陽離子自由基清除率為48.4%，分別約為相同質(zhì)量濃度抗壞血酸（VC）的70%和50%。Lin Jun等利用不同蛋白酶水解大頭魚魚鰓蛋白，發(fā)現(xiàn)其水解物的DPPH自由基清除率在較低濃度可達(dá)60%～80%；顏阿娜利用酶法制備三文魚骨抗氧化肽，最優(yōu)條件下制備的抗氧化肽酶解液的DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率分別為81.64%和71.04%，分子質(zhì)量主要分布在180～1 000 Da，與本研究結(jié)果基本類似。因此，制備的雙效肽同時具有較好的抗凍和抗氧化活性，有望加工成一種多功能魚糜改良劑，同步解決不漂洗魚糜貯藏過程中冷凍損傷和氧化劣變的問題。

2 雙效肽對不漂洗魚糜凍融過程中蛋白質(zhì)變性和氧化的影響

蛋白質(zhì)如圖2a所示，凍融前兩組魚糜樣品的蛋白含量（64.06～66.34 mg/g）無顯著差異（

P

＞0.05），但經(jīng)過凍融循環(huán)處理后，兩組樣品的肌原纖維蛋白含量均劇烈下降，可能是因?yàn)閮鋈谶^程中冰晶的形成和重結(jié)晶導(dǎo)致肌原纖維蛋白脫水變性，致使其溶解性下降，也可能與凍融過程中魚糜氧化劣變引起肌原纖維蛋白過度交聯(lián)聚集有關(guān)。雙效肽組魚糜的肌原纖維蛋白含量下降相對較慢，凍融6 次后下降至17.70 mg/g，降幅比空白組（15.08 mg/g）減少5%。這說明添加雙效肽能一定程度上阻止不漂洗魚糜肌原纖維蛋白的變性和聚集，從而減緩魚糜品質(zhì)劣變，與張金等的研究結(jié)果一致。

Ca2+-ATPase活性通常用作衡量肌球蛋白分子完整性的標(biāo)志物，其變化水平反映了魚糜中肌原纖維蛋白的變性程度。如圖2b所示，經(jīng)過凍融處理后，兩組魚糜的Ca2+-ATPase活性均顯著下降（

P

＜0.05），表明凍融過程中魚糜肌原纖維蛋白會嚴(yán)重變性，主要原因可能是冰晶的形成對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成破壞，以及反復(fù)凍融過程誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)間相互作用、重排、聚集和氧化 。凍融6 次后，雙效肽組的Ca 2+ -ATPase活性由最初的0.27 μg/（min·mg）下降至0.09 μg/（min·mg），保留率（33%）比空白組（0.06 μg/（min·mg），22%）提高11%，表明添加雙效肽減輕了魚糜肌原纖維蛋白的變性程度，從而保護(hù)魚糜蛋白結(jié)構(gòu)完整性和功能性質(zhì)，延緩魚糜凍融過程中的品質(zhì)劣變。Peng Xinyan等 在研究乳清蛋白水解物對魚糜抗凍保護(hù)效果時也觀察到了類似的結(jié)果。此外，兩組魚糜的Ca 2+ -ATPase活性在前3 次凍融循劇烈下降，其后下降速率有所平緩，可能是因?yàn)槠鋬鋈谠缙诘淖兓饕蓜×业奈锢砥茐暮妥畈环€(wěn)定蛋白質(zhì)的快速變性失活主導(dǎo)，而后續(xù)凍融循環(huán)對殘留Ca 2+ -ATPase活性的破壞作用變得緩慢而漸進(jìn)，主要表現(xiàn)為氧化變性、輕微的物理損傷和持續(xù)的品質(zhì)劣化累積效應(yīng) 。

如圖2c所示，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)羰基含量顯著增加（

P

＜0.05），表明凍融過程中魚糜肌原纖維蛋白發(fā)生了氧化反應(yīng)。凍融過程中，活性氧（如羥自由基）、氧化肽裂解以及脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的氧自由基會誘導(dǎo)某些氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為羰基，從而造成蛋白質(zhì)的損傷、聚集和功能特性的喪失 。凍融6 次后，空白組魚糜的蛋白羰基含量由初始值（2.12 nmol/g）增加至4.30 nmol/g，而雙效肽組魚糜蛋白羰基含量為3.55 nmol/g，增幅僅為對照組增幅的65%，說明添加雙效肽對魚糜蛋白羰基形成有一定的抑制作用，可能與雙效肽的抗氧化和抗凍組分有關(guān)，其通過穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)、清除活性氧自由基等作用阻止自由基對肌原纖維蛋白側(cè)鏈的攻擊，從而減輕蛋白氧化損傷和變性 ，增強(qiáng)不漂洗魚糜的凍融穩(wěn)定性。

3 雙效肽對不漂洗魚糜凍融過程中脂質(zhì)氧化的影響

TBARS值是衡量脂質(zhì)二次氧化程度的典型指標(biāo)，尤其是在高脂肪含量的水產(chǎn)品中。如圖2d所示，隨著凍融次數(shù)的增加，兩組魚糜的TBARS值均逐漸升高，表明發(fā)生了一定程度的脂質(zhì)氧化，這與Li Jiayi等報(bào)道的結(jié)果一致。與空白組相比，雙效肽組魚糜的TBARS值全程較低；凍融6 次后，雙效肽組的TBARS值由凍融前的2.88 mg/kg升至4.04 mg/kg，增幅為40%，比空白組（3.09 mg/kg升至5.09 mg/kg，增幅為65%）低25%。這說明添加雙效肽一定程度上抑制了魚糜中脂質(zhì)氧化，這主要與雙效肽較好的抗氧化活性有關(guān)，能通過清除活性氧自由基阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而減輕脂質(zhì)氧化。此外，雙效肽還具有良好的抗凍活性，能抑制冰晶的形成和長大，從而減少凍融過程中機(jī)械損傷引起的肌細(xì)胞促氧化因子（如氧化酶、金屬離子、色素等）釋放，延緩脂質(zhì)氧化和MDA等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成。這也與課題組前期研究鰱魚酶解產(chǎn)物通過雙重抗凍和抗氧化作用抑制不漂洗魚糜中MDA含量升高的結(jié)果一致。

4 雙效肽對不漂洗魚糜凍融過程中凝膠形成能力的影響

不漂洗魚糜凍融處理0、3、6 次循環(huán)后再加工成魚糜凝膠，如圖3所示，凍融前兩組樣品的凝膠強(qiáng)度相當(dāng)，凍融處理后均逐漸下降，表明其凝膠形成能力降低；在反復(fù)凍融過程中，冰晶的多次形成和重結(jié)晶會破壞肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)內(nèi)源酶和促氧化因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化、變性和肌纖維結(jié)構(gòu)完整性喪失，影響魚糜的凝膠形成能力。凍融6 次后，雙效肽組魚糜的凝膠強(qiáng)度降低了24%（從691 g·cm降至526 g·cm），降幅是空白組（32%）的75%，說明添加雙效肽有利于保護(hù)魚糜肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而維持不漂洗魚糜的凝膠形成能力；這得益于雙效肽較好的低溫保護(hù)和抗氧化作用，一定程度上阻止了魚糜蛋白的冷凍變性和氧化損傷。此外，凍融過程中魚糜凝膠形成能力的降低與其肌原纖維蛋白的溶解性和Ca2+-ATPase活性的變化趨勢一致，與Lin Jun和MacDonald等的研究結(jié)果吻合。

5 雙效肽對不漂洗魚糜凝膠凍融損失的影響

魚糜凍融損失常用來評價其貯藏穩(wěn)定性，能反向表征魚糜凝膠的持水能力和結(jié)構(gòu)完整性。如圖4所示，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，兩組魚糜的凍融損失均顯著升高（

P

＜0.05）；凍融損失增加可能是因?yàn)閮鋈谶^程中冰晶的融化和重結(jié)晶對魚糜肌原纖維蛋白和凝膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)性損傷，降低了蛋白質(zhì)的水結(jié)合能力，也可能與脂肪氧化引起的蛋白質(zhì)變性和結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。凍融6 次后，空白組魚糜的凍融損失為2.0%，而相應(yīng)雙效肽組的凍融損失僅為1.2%，顯著低于空白組（

P

＜0.05），說明添加雙效肽提升了不漂洗魚糜凝膠的凍融穩(wěn)定性。這與雙效肽的雙重抗凍和抗氧化作用密切相關(guān)，通過減輕魚糜凝膠的凍融損傷和抑制肌原纖維蛋白的變性、氧化從而保護(hù)魚糜凝膠品質(zhì)。

6 雙效肽對不漂洗魚糜凝膠凍融過程中水分遷移的影響

從圖5a可以看出，不漂洗魚糜凝膠凍融過程有0～10（

T

21 ）、10～100 ms（

T

22 ）和100～1 000 ms（

T

23 ）的3 個峰，其中

T

21 表示與大分子緊密結(jié)合的結(jié)合水，

T

22 表示包裹在肌原纖維網(wǎng)絡(luò)中的物理束縛水，

T

23 表示位于肌原纖維網(wǎng)格外的 自由水。其中，

T

22 的峰面積最大，說明魚糜凝膠中大部分水分為物理束縛水，這與Zhai Yueying等的研究結(jié)果一致。兩組魚糜凝膠的

T

2 曲線基本相似，但與空白組相比，雙效肽組

T

22 的峰位置均略微向更低的弛豫時間移動，表明添加雙效肽降低了魚糜凝膠中水分的自由度。

不同狀態(tài)水的遷移可通過不同水的峰面積百分比反映，凍融過程中對應(yīng)的

T

21、

T

22、

T

23 峰面積比例(

P

21、

P

22、

P

23) 變化如圖5b所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，兩組魚糜凝膠均呈現(xiàn)

P

22 降低，

P

23 升高，表明凝膠中部分物理束縛水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤＿@可能與蛋白質(zhì)功能特性的喪失以及反復(fù)凍融引起的凝膠結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。然而，與空白樣品相比，凍融過程中雙效組魚糜凝膠中

P

23 升高和

P

22 降低的幅度相對更小，說明較少的物理束縛水轉(zhuǎn)化為自由水；凍融6 次后，雙效肽組凝膠的

P

22 和

P

23 分別為86.82%和8.36%，而空白樣品相應(yīng)為84.61%和10.83%。這些結(jié)果表明，不漂洗魚糜凝膠中添加雙效肽有助于限制其水分遷移，從而改善魚糜凝膠的凍融穩(wěn)定性。

7 雙效肽對凍融過程中冰晶生長的影響

圖6a展示了不漂洗魚糜凝膠凍融過程中冰晶的形狀和分布的變化情況，其中不規(guī)則的白色區(qū)域表示冰晶，而紅色區(qū)域代表魚糜凝膠組織。新鮮魚糜樣品僅有些許不易察覺的白點(diǎn)，可能是魚糜凝膠成型過程中留下的小氣孔；3 次凍融循環(huán)后，在兩組中都觀察到許多不規(guī)則的白色區(qū)域，說明凍融過程中魚糜凝膠內(nèi)部形成了許多冰晶，從而對魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)造成機(jī)械損傷，導(dǎo)致凝膠特性下降；6 次凍融循環(huán)后，可觀察到更多大顆粒的冰晶，可能是由于反復(fù)凍融過程誘導(dǎo)冰晶重結(jié)晶形成了更大的冰晶，冰晶體的生長進(jìn)一步破壞了凝膠結(jié)構(gòu)完整性，這與其不斷增加的凍融損失相印證。然而，與空白組樣品相比，相同凍融次數(shù)時雙效肽組凝膠中冰晶尺寸明顯較小，尤其是在凍融6 次的樣品中冰晶大小的差異更加明顯。如圖6b所示，凍融6 次后，空白組魚糜凝膠冰晶平均面積為11 252 μm2，較其凍融3 次時的冰晶平均面積（10 197 μm2）增加了10%；而雙效肽組魚糜凝膠冰晶平均面積約為7 974 μm2，雖然也較凍融3 次時（7 575 μm2）增加了5%，但僅為相同凍融循環(huán)次數(shù)時空白組的71%。這些發(fā)現(xiàn)表明，雙效肽抑制了較大冰晶的形成，從而減輕魚糜凝膠結(jié)構(gòu)在反復(fù)凍融循環(huán)期間的機(jī)械損傷。有研究指出抗凍肽可以吸附在冰晶表面通過Kelvin效應(yīng)抑制冰晶生長，阻止冰晶聚集和重結(jié)晶，從而控制冰晶的大小和形狀，使形成的冰晶細(xì)小均勻。雙效肽中含有較多分子質(zhì)量小于1.2 kDa的抗凍組分，能不可逆地附著于冰晶特定表面有效抑制冰晶生長、修飾冰晶形態(tài)和重結(jié)晶，從而降低冰晶對魚糜凝膠造成的機(jī)械損傷，這與Liang Jiajian等的研究結(jié)果相符。

結(jié)論

反復(fù)凍融循環(huán)會導(dǎo)致不漂洗魚糜品質(zhì)劣變，表現(xiàn)為其凝膠形成能力降低、解凍損失增加、TBARS值上升，以及蛋白Ca2+-ATPase活性下降、羰基含量上升。魚糜加工過程中產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，利用其酶解制備雙效的抗凍、抗氧化肽，用于改善不漂洗魚糜的貯藏穩(wěn)定性，具有營養(yǎng)、健康的特性，同時又兼顧效益和效率等優(yōu)勢。通過中性蛋白酶水解魚糜加工副產(chǎn)物，成功制備出雙效肽，具有較好的熱滯活性、酵母菌低溫保護(hù)活性及DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除活性；將其加入不漂洗魚糜中能有效抑制凍融過程中冰晶長大及蛋白質(zhì)冷凍變性，減緩脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化，減少其水分遷移和冷凍損失，從而提高不漂洗魚糜及其凝膠的凍融穩(wěn)定性。因此，雙效肽可用作一種新型的多功能添加劑，同時解決不漂洗魚糜凍藏過程中防止氧化和抗凍保護(hù)的難題。然而，目前的雙效肽是混合肽，具體的肽種類以及單獨(dú)抗凍肽和抗氧化肽如何協(xié)同發(fā)揮作用仍需要進(jìn)一步研究明確。

本文《抗凍/抗氧化雙效肽對不漂洗魚糜凍藏品質(zhì)的調(diào)控》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第20期297-305頁，作者：江祥瑤，戴新佳，何 斌，尹世鮮，劉永樂，李向紅，王發(fā)祥。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250428-239。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：楊欣瑞；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)