作者：閔

腫瘤基因檢測的點(diǎn)突變、擴(kuò)增以及融合等突變類型與我們的治療息息相關(guān)，如EGFR基因的點(diǎn)突變、ALK基因融合突變等等。除了這些突變類型以外，還有另一種突變形式名為“甲基化”，它們很少出現(xiàn)在廣大病友的視線里，但卻與癌癥發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。甲基化檢測相比其他腫瘤基因相關(guān)檢測有些“默默無聞”，今天就給大家介紹一下這個小透明，順便聊聊它們的優(yōu)勢與缺陷。

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什么是DNA甲基化？

DNA甲基化是基因表觀修飾的方式之一，可以調(diào)控基因表達(dá)的時機(jī)及表達(dá)的量度，具有十分重要的生物意義?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，包括腫瘤、糖尿病以及自身免疫性疾病等等。現(xiàn)有研究表明多種癌癥的發(fā)生發(fā)展與DNA甲基化有關(guān)。甲基化通常抑制基因表達(dá)，比如在腫瘤發(fā)生時，抑癌基因CpG島（C為胞嘧啶，G為鳥嘌呤，二者會在DNA部分區(qū)域高度聚集，類似海中的小島，故稱為“CpG島”）中的CpG呈高度甲基化會使得抑癌基因表達(dá)下降，這就給了癌癥可乘之機(jī)。

以上是DNA甲基化的生物學(xué)作用，它在分子層面的本質(zhì)是指在DNA甲基化酶的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，并將甲基團(tuán)選擇性添加到胞嘧啶上形成5’-胞嘧啶的過程。

打個比方，這就像是給胞嘧啶戴上了一頂名為“甲基”的帽子，讓原本認(rèn)識它的工友不認(rèn)識他了，使得他的工作不易開展。

DNA甲基化通常發(fā)生在CpG或者CpHpG密集的點(diǎn)位，這類成簇的CpG島大多在基因的啟動子區(qū)域。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類60%的基因啟動子會含有此類CpG島，半數(shù)以上的編碼基因與CpG島有關(guān)。

圖片來源：包圖網(wǎng)

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DNA甲基化的檢測方式

DNA甲基化可使用PCR、NGS以及質(zhì)譜等方式檢測。與各位熟悉的腫瘤基因檢測不同的是，甲基化檢測最常選用的檢測方式為PCR。

PCR技術(shù)簡便、高效、快速、可重復(fù)的特點(diǎn)對于甲基化檢測是重要的優(yōu)勢。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路的不同，甲基化檢測的PCR技術(shù)還可以細(xì)分為甲基化特異性PCR、甲基化特異性的高分辨率溶解曲線法以及數(shù)字PCR法，三者間各有側(cè)重點(diǎn)。

NGS高通量的特點(diǎn)在此并不占很大優(yōu)勢，相反其操作繁瑣、技術(shù)復(fù)雜的特點(diǎn)在甲基化檢測中成為了劣勢。

除了這二者以外，還有一項(xiàng)各位不太熟悉的檢測技術(shù)可用于甲基化的檢測，那就是質(zhì)譜技術(shù)。核酸質(zhì)譜平臺可以同時檢測數(shù)個至數(shù)十個DNA甲基化標(biāo)志物，檢測通量適中，質(zhì)譜還可以獲得最大500bp范圍之內(nèi)全部連續(xù)的CpG位點(diǎn)的甲基化定量水平信息。質(zhì)譜有時受到遺傳多態(tài)性的DNA序列干擾，降低酶切片段質(zhì)量從而影響定量分析結(jié)果。

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DNA甲基化檢測有何用處，是否靠譜？

前文介紹了DNA甲基化的生物學(xué)功能及檢測方式，該項(xiàng)技術(shù)在臨床及市場化應(yīng)用主要集中在癌癥早期篩查領(lǐng)域。近年來甲基化檢測的早篩產(chǎn)品層出不窮，篇幅限制不一一介紹，筆者選取一款較為經(jīng)典且個人比較熟悉的甲基化檢測項(xiàng)目作為代表，向大家簡單介紹這類檢測的具體用途。

Septin9甲基化檢測應(yīng)該是國內(nèi)最早投入使用的甲基化標(biāo)志物，它起初主要用于腸道腫瘤的早期篩查。Septin家族是一個廣泛存在于除植物以外的絕大多數(shù)真核生物中的基因家族，它們參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)的分泌和運(yùn)輸，具有十分重要的生物學(xué)功能。Septin9屬于SEPT3亞家族，Septin9甲基化與腸癌的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)，其在腸癌的各個階段（I-IV期）均有檢出且隨著分期越靠后其檢出率越高。由于Septin9甲基化檢測的定位是早期篩查，因此它采用血液作為常規(guī)樣本，與我們熟悉的腫瘤基因檢測有所不同。2011年，德國一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)I期腸癌患者中約有71%的患者檢測到Septin9甲基化，III期及IV期患者檢出率逼近100%[1]。

圖片來源：作者提供

同一研究中，德國學(xué)者納入了50名未經(jīng)治療的結(jié)直腸癌患者以及94名健康人群作為對照，并定義靈敏度為X/50及特異性為（1-X/94）。靈敏度體現(xiàn)了該檢測篩查并發(fā)現(xiàn)潛在腸癌患者的能力，而特異性體現(xiàn)了該檢測誤診健康人群的概率（特異性越高越不易受其他因素干擾）。最終該研究發(fā)現(xiàn)Septin9甲基化檢測的靈敏度達(dá)90.0%，特異性則為88.3%。

2014年我國曾有過一版《中國早期結(jié)直腸癌篩查及內(nèi)鏡診治指南》（后簡稱指南），該指南就納入了Septin9甲基化檢測，與糞便潛血實(shí)驗(yàn)并列作為低危人群初篩的手段[2]。

自Septin9甲基化檢測在國內(nèi)成功獲得注冊證及相關(guān)指南認(rèn)可后，DNA甲基化檢測項(xiàng)目如雨后春筍般不斷出現(xiàn)，至今已獲得我國NMPA批準(zhǔn)的相關(guān)試劑盒多達(dá)數(shù)十種，這里就不按具體試劑盒列舉，只標(biāo)注有哪些DNA甲基化檢測項(xiàng)目，以供各位了解。

除了上表中已拿證產(chǎn)品，還有諸如UriMee等與專家合作研發(fā)的LDT檢驗(yàn)項(xiàng)目，DNA甲基化檢測項(xiàng)目的數(shù)量遠(yuǎn)比這些要多。

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DNA甲基化檢測仍有缺陷？

我們?nèi)砸許eptin9甲基化檢測為例，盡管它已被納入相關(guān)篩查指南，但始終沒有在全國廣泛應(yīng)用，受到幾點(diǎn)關(guān)鍵缺陷制約。

雖然它在德國的研究中展現(xiàn)出不俗的靈敏度與特異性，但經(jīng)其他多項(xiàng)研究后驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這兩項(xiàng)數(shù)據(jù)并不穩(wěn)定。2016年一項(xiàng)匯總研究綜合14項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Septin9甲基化檢測整體靈敏度僅60%，特異性為91%。靈敏度如此大的波動可能受患者數(shù)量、檢測技術(shù)、乃至檢測基因單一等因素限制，好在特異性表現(xiàn)還算穩(wěn)定[3]。

Septin9甲基化檢測對標(biāo)的是糞便潛血實(shí)驗(yàn)（iFOBT），后者是當(dāng)下腸癌篩查常用的方式之一，但苦于靈敏度偏低且特異性也不理想，易受腸道潰瘍、炎癥甚至痔瘡等多種肛腸疾病干擾。鑒于糞便潛血的篩查性能有限，臨床上也需要其他方式來更好的篩查出潛在的腸癌患者以便及時治療。

臺灣的一項(xiàng)研究對比了iFOBT與Septin9甲基化檢測的性能，結(jié)果Septin9甲基化檢測的靈敏度為61.8%，特異性為89.6%，而iFOBT這二項(xiàng)數(shù)據(jù)分別為61.4%與70.3%，二者相結(jié)合可將靈敏度提升至84.1%[4]。以往也有研究綜合三個類似對比試驗(yàn)，其得到的結(jié)論也與臺灣的研究相近，尷尬表明Septin9甲基化檢測的性能僅略優(yōu)于iFOBT。

如上所示，Septin9甲基化檢測的檢測性能對比iFOBT這種基本篩查方式提升有限，達(dá)不到替代病理的程度，二者陽性皆需做腸鏡復(fù)核確認(rèn)，加之其檢查費(fèi)用又高出許多（Septin9甲基化曾在江蘇省定價1000元/次，相較之下糞便潛血僅六七十元），種種原因相加致使它的推廣受阻。其余DNA甲基化檢測多少與之類似，難免有些食之無味、棄之可惜，這才讓整個甲基化篩查領(lǐng)域受冷。

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展望

DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是完善腫瘤早期篩查，實(shí)現(xiàn)早診早治理念的有效工具，但仍有需要改進(jìn)的地方?，F(xiàn)在的甲基化檢測正在向多基因聯(lián)合檢測的方向發(fā)展，想必可進(jìn)一步提升靈敏度與特異性，然而另一方面也需要與實(shí)際應(yīng)用結(jié)合，成為老百姓真正能用得起用得上的防癌好幫手。

參考文獻(xiàn)

[1].Warren J D, Xiong W, Bunker A M, et al. Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer[J]. BMC medicine, 2011, 9(1): 133.

[2].柏愚, 楊帆, 馬丹, 等. 中國早期結(jié)直腸癌篩查及內(nèi)鏡診治指南 (2014 年, 北京)[J]. 胃腸病學(xué), 2015, 20(6): 345-365.

[3].Yan S, Liu Z, Yu S, et al. Diagnostic value of methylated septin9 for colorectal cancer screening: a meta-analysis[J]. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2016, 22: 3409.

[4].Xie L, Jiang X, Li Q, et al. Diagnostic value of methylated Septin9 for colorectal cancer detection[J]. Frontiers in oncology, 2018, 8: 247.

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