豌豆分離蛋白（PPI）是一種非轉(zhuǎn)基因和低致敏性的植物蛋白，近年來受到廣泛關(guān)注。凝膠性是PPI的重要性質(zhì)之一，由于PPI含硫氨基酸含量少，其形成的凝膠中二硫鍵數(shù)量也較少，凝膠特性較弱。根據(jù)誘導(dǎo)方式的不同，PPI凝膠可分為熱誘導(dǎo)凝膠和冷誘導(dǎo)凝膠。研究表明，Ca2＋既能增強(qiáng)熱誘導(dǎo)PPI凝膠特性，也能夠誘導(dǎo)PPI形成冷誘導(dǎo)凝膠。此外，Ca2＋濃度會影響蛋白凝膠特性。

河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院的萬昕冉、朱婷偉和郭興鳳*等人研究制備不同Ca2＋濃度的熱誘導(dǎo)和冷誘導(dǎo)PPI凝膠，通過測定持水性、凝膠強(qiáng)度和流變學(xué)特性深入對比熱誘導(dǎo)凝膠和冷誘導(dǎo)凝膠的凝膠特性；通過測定分子間作用力、Zeta電位、表面疏水性、游離巰基、二硫鍵、二級結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)分析造成熱誘導(dǎo)和冷誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)差異的原因，并解析Ca2＋對熱誘導(dǎo)和冷誘導(dǎo)PPI凝膠的影響機(jī)理。

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Ca2＋對PPI凝膠外觀形態(tài)的影響

如圖2所示，不添加Ca2＋的PPI凝膠塌軟。隨著體系中Ca2＋濃度的增加，凝膠外觀形態(tài)逐漸變得平滑，結(jié)構(gòu)變得牢固。當(dāng)Ca2＋濃度為15 mmol/L時，熱凝膠和冷凝膠都達(dá)到最佳形態(tài)。當(dāng)Ca2＋濃度≥20 mmol/L時，熱凝膠和冷凝膠的高度開始降低，且熱凝膠出現(xiàn)水分析出的現(xiàn)象。結(jié)果表明，低濃度Ca2＋可以改善PPI熱凝膠和冷凝膠特性，而高濃度Ca2＋會使凝膠特性變差；熱凝膠的結(jié)構(gòu)較為牢固，冷凝膠沒有出現(xiàn)水分析出現(xiàn)象。

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Ca2＋對PPI凝膠強(qiáng)度及持水性的影響

凝膠強(qiáng)度反映了凝膠網(wǎng)絡(luò)中分子間相互作用程度，是評價凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。圖3為熱凝膠和冷凝膠的凝膠強(qiáng)度及持水性。隨著體系中Ca2＋濃度的增加，熱凝膠和冷凝膠的凝膠強(qiáng)度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)Ca2＋濃度為15 mmol/L時凝膠強(qiáng)度均達(dá)到最大，分別為58.82 g和44.30 g。這表明低濃度的Ca2＋（≤15 mmol/L）可增強(qiáng)PPI凝膠強(qiáng)度。Ca2＋可以屏蔽蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的負(fù)電荷，減弱分子鏈間的斥力，增強(qiáng)蛋白質(zhì)間相互作用，促進(jìn)蛋白聚集；另一方面，Ca2＋可以與蛋白鏈上帶負(fù)電的基團(tuán)如羧基結(jié)合，在相鄰肽鏈間形成鈣橋，因此Ca2＋能夠增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)度。當(dāng)Ca2＋濃度＞15 mmol/L時，熱凝膠和冷凝膠強(qiáng)度開始降低。高濃度Ca2＋會破壞蛋白質(zhì)的水化作用，使得水分被排出，出現(xiàn)水與蛋白質(zhì)分離現(xiàn)象，蛋白溶解度降低，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)粗糙，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度降低。這與劉德陽等的研究結(jié)果相同。對比熱凝膠和冷凝膠發(fā)現(xiàn)，在相同Ca2＋濃度下熱凝膠的凝膠強(qiáng)度均大于冷凝膠，這表明熱凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更牢固，從圖2也可以看出熱凝膠的高度大于冷凝膠。這可能是因為熱凝膠中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)于冷凝膠。

凝膠持水性取決于凝膠網(wǎng)絡(luò)的致密程度及蛋白質(zhì)-水的相互作用。如圖3所示，隨著體系中Ca2＋濃度增加，熱凝膠和冷凝膠的持水性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)Ca2＋濃度為5 mmol/L時凝膠持水性達(dá)到最大，分別為97.71%和99.62%。這表明低濃度的Ca2＋（≤5 mmol/L）能夠增強(qiáng)凝膠持水性。Ca2＋可以與蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電的親水基團(tuán)等結(jié)合形成鹽橋，促進(jìn)了蛋白的交聯(lián)聚集從而增加了凝膠網(wǎng)絡(luò)的致密程度，水分被物理截留在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，因此持水性增加。但Ca2＋濃度＞5 mmol/L時凝膠的持水性開始下降。這是由于隨著Ca2＋濃度的增加，Ca2＋與PPI中親水基團(tuán)結(jié)合增加，削弱了親水基團(tuán)與水分子的相互作用，導(dǎo)致蛋白與水分離，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)粗糙不均勻，網(wǎng)絡(luò)空隙較大，因此熱凝膠和冷凝膠的持水性下降。對比熱凝膠和冷凝膠發(fā)現(xiàn)，在相同Ca2＋濃度下熱凝膠的持水性低于冷凝膠。熱凝膠在Ca2＋濃度≥20 mmol/L時水分析出現(xiàn)象嚴(yán)重，而冷凝膠未出現(xiàn)水分析出現(xiàn)象（圖2），這也表明冷凝膠持水性較好。這可能是由于熱凝膠網(wǎng)絡(luò)孔隙大且蛋白質(zhì)與水的相互作用小于冷凝膠，導(dǎo)致熱凝膠的持水性較差。由于Ca2＋濃度為25 mmol/L時凝膠結(jié)構(gòu)劣化較為嚴(yán)重，凝膠強(qiáng)度和持水性均低于未添加Ca2＋凝膠，故后續(xù)不再對其進(jìn)行研究。

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Ca2＋對PPI凝膠動態(tài)流變學(xué)特性的影響

對凝膠進(jìn)行頻率掃描得到的頻率變化曲線在一定程度上可以反映凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的變化情況。如圖4所示，在相同頻率條件下，加入Ca2＋后PPI熱凝膠和冷凝膠的儲能模量G’和損耗模量G”較未添加Ca2＋的凝膠均大幅增加。但當(dāng)Ca2＋濃度＞15 mmol/L時，熱凝膠和冷凝膠的G’和G”開始下降。這表明低濃度的Ca2＋（≤15 mmol/L）能夠增強(qiáng)PPI凝膠的黏彈性。G”與G’的比值為損耗角正切tanδ，tanδ越小表明體系固體特性越強(qiáng)。在測量的頻率范圍內(nèi)，加入Ca2＋后凝膠的tanδ均小于未添加Ca2＋凝膠，表明Ca2＋增強(qiáng)了PPI熱凝膠和冷凝膠的固體特性。這歸因于Ca2＋與蛋白表面負(fù)電荷通過靜電相互作用形成鈣橋，促進(jìn)PPI交聯(lián)聚集，從而加強(qiáng)了PPI凝膠結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。對比熱凝膠和冷凝膠發(fā)現(xiàn)，在相同Ca2＋濃度及相同頻率下，熱凝膠的tanδ小于冷凝膠。這表明熱凝膠的固體特性更強(qiáng)，熱凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)度更大。相同Ca2＋濃度下熱凝膠的凝膠強(qiáng)度大于冷凝膠（圖3）。因此，低濃度的Ca2＋（≤15 mmol/L）可增強(qiáng)PPI熱凝膠和冷凝膠的黏彈性及固體特性，熱凝膠的黏彈性和固體特性強(qiáng)于冷凝膠。

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Ca2＋對PPI凝膠分子間作用力的影響

為了探究造成熱凝膠和冷凝膠的凝膠強(qiáng)度及持水性產(chǎn)生差異的原因，測定了熱凝膠和冷凝膠的分子間作用力，結(jié)果如圖5所示。隨著Ca2＋濃度的增加，熱凝膠和冷凝膠中蛋白分子間的靜電相互作用呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。Ca2＋可以與PPI表面帶負(fù)電的基團(tuán)通過靜電相互作用結(jié)合。因此隨著Ca2＋濃度增加，靜電相互作用增加（圖5A）。熱凝膠和冷凝膠體系中氫鍵含量隨著Ca2＋濃度增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在Ca2＋濃度為5 mmol/L 時達(dá)到最大，此時與未添加Ca2＋凝膠相比分別增加了27.56%和38.25%（圖5B）。Ca2＋可以與蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電的親水基團(tuán)通過靜電相互作用結(jié)合，同時這些親水基團(tuán)之間也能通過氫鍵結(jié)合。因此隨著Ca2＋濃度的增加，靜電相互作用增加，親水基團(tuán)之間的氫鍵作用被削弱，導(dǎo)致氫鍵含量下降。熱凝膠和冷凝膠體系中疏水相互作用和二硫鍵含量隨著Ca2＋濃度的增加先增加后減少，在Ca2＋濃度為15 mmol/L時達(dá)到最大（圖5C、D）。這是由于Ca2＋通過形成鹽橋增強(qiáng)了PPI分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子會發(fā)生疏水聚集，因此疏水相互作用增加。且疏水相互作用的增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集程度增加，這促進(jìn)了更多游離巰基氧化形成二硫鍵，使得體系中二硫鍵含量隨著Ca2＋濃度的增加而增加。但Ca2＋濃度＞15 mmol/L時體系中疏水相互作用和二硫鍵降低（圖5D），這是由于高濃度Ca2＋使蛋白質(zhì)分子過度聚集，阻礙了疏水基團(tuán)和游離巰基的暴露，導(dǎo)致體系中疏水相互作用和二硫鍵含量減少。

對比熱凝膠和冷凝膠中分子間相互作用力發(fā)現(xiàn)，在相同Ca2＋濃度下，熱凝膠體系中靜電相互作用、疏水相互作用和二硫鍵含量都大于冷凝膠。這表明熱凝膠中蛋白質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)于冷凝膠，因此熱凝膠強(qiáng)度大于冷凝膠。在Ca2＋存在的條件下對PPI進(jìn)行熱處理，能夠使Ca2＋與PPI表面更多的負(fù)電荷結(jié)合，并且促進(jìn)了PPI中更多疏水基團(tuán)和游離巰基的暴露，這有利于疏水相互作用的形成及游離巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵。因此熱凝膠中的疏水相互作用和二硫鍵含量大于冷凝膠。綜上，熱凝膠的靜電相互作用、疏水相互作用和二硫鍵含量大于冷凝膠，因此熱凝膠中PPI之間的相互作用強(qiáng)于冷凝膠，熱凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)度大于冷凝膠。

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Ca2+對PPI Zeta電位的影響

Zeta電位能夠表征體系中蛋白質(zhì)之間的排斥程度，可以反映蛋白質(zhì)分子的聚集狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密程度。如圖6所示，隨著Ca2＋濃度的增加，PPI溶液的Zeta電位絕對值呈現(xiàn)降低趨勢，這表明PPI中表面負(fù)電荷減少。Ca2＋的加入會與肽鏈上帶負(fù)電荷的氨基酸如羧基等通過靜電相互作用結(jié)合，因此隨著體系中Ca2＋濃度的增加，負(fù)電荷減少，靜電斥力降低，PPI聚集程度增加。當(dāng)體系中Ca2＋濃度達(dá)到20 mmol/L時，PPI的Zeta電位絕對值不再降低。Ca2＋濃度增加的同時CaCl2中Cl－濃度也在增加，導(dǎo)致體系中的負(fù)電荷有所增加。Guo Ruqi等也同樣發(fā)現(xiàn)隨著CaCl2濃度的增加會導(dǎo)致Cl－的引入。不添加Ca2＋的蛋白溶液中，經(jīng)過加熱的蛋白溶液Zeta電位絕對值小于未加熱蛋白溶液，這表明加熱后的蛋白溶液表面負(fù)電荷減少。其原因是蛋白加熱后結(jié)構(gòu)重排導(dǎo)致表面帶負(fù)電基團(tuán)逐漸被包埋，使得負(fù)電荷減少。在此基礎(chǔ)上，當(dāng)加入Ca2＋后經(jīng)過加熱的蛋白溶液中能與Ca2＋結(jié)合的負(fù)電基團(tuán)減少，因此形成的冷凝膠中靜電相互作用小于熱凝膠。在相同Ca2＋濃度下，加熱蛋白溶液體系中的Zeta電位絕對值小于未加熱的蛋白溶液體系，表明加熱后的蛋白溶液體系穩(wěn)定性低，蛋白溶液的聚集程度大，因此形成的冷凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，持水性較好，這與第2節(jié)結(jié)果相印證。

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Ca2+對PPI凝膠中蛋白表面疏水性的影響

H

0 能夠反映蛋白質(zhì)疏水區(qū)域的暴露程度，從而反映出疏水相互作用的變化情況 。如圖 7 所示，隨著 Ca 2＋ 濃度的增加，體系

H

0 呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，當(dāng) Ca 2＋ 濃度為 15 mmol / L 時蛋白 H 0 最低。低濃度 Ca 2＋ （≤ 1 5 mmol / L ）降低了蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，促進(jìn)了蛋白質(zhì)聚集，疏水基團(tuán)包埋在聚集體內(nèi)部，從而降低了凝膠體系的

H

0 。高濃度 Ca 2＋ （＞ 15 mmol / L ）破壞了蛋白質(zhì)表面的水化層，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的親水性降低， PPI 排斥水分子，從而增加了

H

0 。對比熱凝膠和冷凝膠的

H

0 發(fā)現(xiàn)，熱凝膠的 H 0 小于冷凝膠，這是由于 Ca 2＋ 存在的條件下對蛋白進(jìn)行熱處理促進(jìn)了疏水基團(tuán)的暴露，增強(qiáng)了疏水相互作用，使蛋白的聚集程度增加 ，導(dǎo)致熱凝膠內(nèi)部的疏水殘基被包埋，其

H

0 小于冷凝膠。

7

Ca2+對PPI凝膠中游離巰基及二硫鍵的影響

游離巰基暴露在蛋白質(zhì)分子的表面，在凝膠形成過程中可以通過氧化作用形成二硫鍵，通過測定游離巰基及二硫鍵含量能夠反映蛋白構(gòu)象變化，結(jié)果如圖8所示。隨著Ca2＋濃度的增加，熱凝膠和冷凝膠的游離巰基含量先減少后增加，二硫鍵含量先增加后減少，當(dāng)Ca2＋濃度為15 mmol/L時，體系中游離巰基含量最低，二硫鍵含量最高。低濃度的Ca2＋（≤15 mmol/L）中和了蛋白質(zhì)表面的負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)之間的靜電斥力減小，蛋白質(zhì)聚集，部分游離巰基氧化形成二硫鍵，因此游離巰基含量減少，二硫鍵含量增加。Ca2＋濃度過高（＞15 mmol/L）時蛋白過度聚集，部分游離巰基被包埋，阻礙了二硫鍵的形成。這與Wang Yaru等的研究結(jié)果相同。對比熱凝膠和冷凝膠的游離巰基及二硫鍵含量發(fā)現(xiàn)，熱凝膠體系中游離巰基含量少于冷凝膠，其二硫鍵含量大于冷凝膠。在Ca2＋存在的條件下對PPI進(jìn)行熱處理能夠增加游離巰基的暴露程度，這有利于游離巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，從而增加二硫鍵的含量，這導(dǎo)致熱凝膠的凝膠強(qiáng)度大于冷凝膠（圖3）。

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Ca2+對PPI凝膠中蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜可以分析蛋白質(zhì)的構(gòu)象和官能團(tuán)的變化。選擇不添加Ca2＋的PPI凝膠以及凝膠特性改善效果最佳的Ca2＋濃度（15 mmol/L）制備PPI的熱凝膠和冷凝膠進(jìn)行分析，如圖9所示，1 600～1 700 cm－1由酰胺I帶（藍(lán)色框）中C—O拉伸振動產(chǎn)生，是蛋白質(zhì)的特征吸收帶。隨著Ca2＋濃度增加，蛋白質(zhì)特征帶對應(yīng)的吸收峰沒有明顯的偏移，表明Ca2＋與PPI不存在共價交聯(lián)。

將酰胺I帶去卷積后分析得到蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果如表1所示。PPI二級結(jié)構(gòu)中以

- 折疊為主。與對照組相比，熱凝膠和冷凝膠中 PPI 的 β - 折疊相對含量顯著增加，分別從不添加 Ca 2＋ 時的 31.77 % 增加至 41.74 % 和41.51 % ， α - 螺旋及無規(guī)卷曲顯著降低。這表明 Ca 2＋ 的加入使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)變。 Ca 2＋ 的加入促進(jìn)了 PPI聚集，導(dǎo)致蛋白分子 β - 折疊結(jié)構(gòu)相對含量顯著增加 。β - 折疊屬于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的有序結(jié)構(gòu)，其含量增加有利于凝膠結(jié)構(gòu)的有序形成 。這說明相較于對照組，添加15 mmol / L Ca 2＋ 熱凝膠和冷凝膠的結(jié)構(gòu)更加緊密有序。熱膠和冷凝膠中蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量并沒有顯著差異。

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Ca2＋對PPI凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步直觀對比Ca2＋對熱、冷凝膠結(jié)構(gòu)的影響，通過掃描電鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)。如圖10所示，對照組的PPI凝膠表面粗糙不平，疏松多孔。與對照組相比，熱凝膠和冷凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯，且較為有序。這是由于Ca2＋的加入可以使蛋白形成鹽橋，促進(jìn)了蛋白的聚集，因此凝膠網(wǎng)絡(luò)中的孔隙減少，結(jié)構(gòu)變得有序和均勻。對比熱凝膠和冷凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，熱凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加有序均勻，冷凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密。這是由于熱凝膠中分子間的靜電相互作用、疏水相互作用和二硫鍵含量較多，PPI之間的相互作用強(qiáng)，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有序均勻，因此熱凝膠的凝膠強(qiáng)度大。在冷凝膠形成過程中，PPI的帶負(fù)電荷基團(tuán)在加熱后被包埋，靜電斥力變小，PPI的聚集程度增大，導(dǎo)致形成的冷凝膠網(wǎng)絡(luò)致密，因此冷凝膠的持水性好。

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熱凝膠和冷凝膠的形成機(jī)理

如圖11所示，在熱凝膠的形成過程中，加入的Ca2＋先與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，降低了體系中的靜電斥力；且Ca2＋與蛋白質(zhì)分子間形成鹽橋，促進(jìn)部分蛋白交聯(lián)。加熱處理后，蛋白變性使肽鏈展開，促進(jìn)了疏水相互作用以及游離巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，在這些作用力下PPI聚集形成均勻有序的熱凝膠網(wǎng)絡(luò)。在冷凝膠的形成過程中，首先通過加熱使蛋白變性，肽鏈展開，疏水基團(tuán)及部分游離巰基暴露，在疏水相互作用和二硫鍵的作用下蛋白聚集。隨后Ca2＋的加入中和了帶負(fù)電基團(tuán)，減小靜電斥力，促使聚集體進(jìn)一步聚集形成致密的冷凝膠網(wǎng)絡(luò)。熱凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻有序；冷凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密。這是由于先加入Ca2＋后加熱蛋白有利于疏水基團(tuán)和游離巰基的暴露，因此更多的游離巰基轉(zhuǎn)換為二硫鍵，疏水相互作用增強(qiáng)，因此熱凝膠網(wǎng)絡(luò)有序均勻。冷凝膠中先加熱蛋白使其形成聚集體，之后Ca2＋交聯(lián)蛋白聚集體進(jìn)一步形成緊密的凝膠網(wǎng)絡(luò)。且冷凝膠中的氫鍵含量多，氫鍵作用距離較短，因此冷凝膠網(wǎng)絡(luò)致密。

結(jié)論

通過探究Ca2＋濃度對熱凝膠和冷凝膠特性和結(jié)構(gòu)特性的影響發(fā)現(xiàn)，低濃度的Ca2＋（≤15 mmol/L）可通過增加體系中靜電相互作用、疏水相互作用和二硫鍵含量從而增強(qiáng)熱凝膠和冷凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。高濃度Ca2＋（＞15 mmol/L）減小了體系中的分子間相互作用，從而降低熱凝膠和冷凝膠的凝膠特性。熱凝膠體系中靜電相互作用、疏水相互作用及二硫鍵含量多，其凝膠強(qiáng)度大；冷凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，其凝膠持水性較好。本研究結(jié)果證實(shí)，低濃度Ca2＋（≤15 mmol/L）可增強(qiáng)PPI凝膠特性，其中Ca2＋濃度為15 mmol/L改善PPI凝膠特性效果最佳；PPI熱凝膠和冷凝膠特性的差異是由于分子間作用力及凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密度不同所致。這一結(jié)果可為PPI凝膠特性的改善提供新思路和理論參考。

本文《Ca2＋對豌豆蛋白熱誘導(dǎo)和冷誘導(dǎo)凝膠特性及結(jié)構(gòu)的影響》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第16期72-80頁，作者：萬昕冉, 朱婷偉, 逯子嬌, 楊月, 齊改改, 崔婉, 郭興鳳, 陳復(fù)生。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20250117-133。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：魏雨諾；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)